22土壤中分解尿素的微生物的分离和计数课件.ppt

1、常见的分解尿素的微生物常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌芽孢杆菌小球菌小球菌假单胞杆菌假单胞杆菌克氏杆菌克氏杆菌棒状杆菌棒状杆菌某些真菌某些真菌放线菌放线菌等等等等允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌

2、生长多种生长多种微生物微生物是是1直接计数法：直接计数法：最常用显微镜直接计数法。最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。算出单位体积内的微生物总数。测定微生物数量的方法：测定微生物数量的方法：背景知识背景知识优点：优点：设备简单、能观察微生物的形设备简单、能观察微生物的形态特征。态特征。缺点：缺点：难以计数微小量多的细菌。难以计数微小量多的细菌。一般用于纯培养悬浮液中各一般用于纯培养悬浮

3、液中各种单细胞菌体的计数。种单细胞菌体的计数。2间接计数法：间接计数法：最常用稀释平板计数法。最常用稀释平板计数法。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落

4、数在数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=(CV)MC：某一稀释度下平板上生长的平均：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积：涂布平板时所用的稀释液的体积 (ml)M：稀释倍数：稀释倍数相关计算相关计算某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B统计的菌落往往统计的菌落往往比比活菌的实际数目低。活菌的实际数目低。这是因为当两个或多这是因为当两个或多个细胞连在一起

5、时，平板上观察到个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。的只是一个菌落。因此结果一般用因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。菌落数而不是活菌数来表示。注意：注意：两两位同学用稀释涂布平板法测定位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为倍数为106的培养基中，得到以下两种统的培养基中，得到以下两种统计结果。计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该浓度下涂布了三个第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为平板，统计的菌落数分

6、别为21、212和和256，该同学以这三个平板菌落数的平均，该同学以这三个平板菌落数的平均值值163作为统计结果。作为统计结果。实例实例1第一位同学只涂布了一个平板，第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了的问题，涂布了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另2个相差太远，个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将此，不能简单地将3个平板的计数值用个平板的计数值用来求平均值

7、。来求平均值。?你认为哪位同学的结果更接你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？要改进吗？如果需要，如何改进？因此，这两位同学的实验需要改进，因此，这两位同学的实验需要改进，在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要实验。果不一致，意味着操作有误，需要实验。说明设

8、置重复组的重要性。说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，个平板，增强实验的说服力与准确性增强实验的说服力与准确性。在分析实验结。在分析实验结果时，果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验要重新实验。设置实验设置实验1.概念：是指除了被测试条件以外，其概念：是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除其他可能原因的干扰，证明验组，排除其他可能原因的干扰，证明确实是测试

9、的条件引起相应的结果。确实是测试的条件引起相应的结果。2.目的：排除实验组中非测试因素对实目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度。验结果的影响，提高实验的可信度。（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基接种后培养观察菌落数目。完全培养基接种后培养观察菌落数目。在在做本课题的实验时，做本课题的实验时，A同学从同学从对应对应106倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是

10、，其它同学在同样的稀释度个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约下只选择出大约50个菌落。个菌落。其他同学认为其他同学认为A同学的结果有问题。同学的结果有问题。他们分析可能是他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。在该培养基上生长。实例实例2但是，但是，A同学确信自己的实验操同学确信自己的实验操作准确作准确无误，与其他同学的结果之所无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤以不相同，是因为自己所选用的

11、土壤样品不同。样品不同。但是，但是，A同学确信自己的实验操同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，样品不同。但是，A同学在设计实验同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A同学同学排除上述两个可能影响实验结果的因排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？素吗？一是由于土样不同，二是由于培一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个

12、原养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。因，可以通过实验来证明。一一是由于土样不同，二是由于培是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。因，可以通过实验来证明。一种方案：可以由其他同学用与一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果同学一样的土样进行实验，如果结果与与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如果结无误；如果结果不同，则证明果不同，则证明A同学存在操作失误或同学存在操作失误或培养基的配制有问题。培养基的配制有问题。另一种方案：另一种方案：将将A同学配制的培养基在不加土同学

13、配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。不可少的。实验设计流程实验设计流程 1.土壤取样土壤取样 2.制备培养基制备培养基 3.样品的稀释样品的稀释 4.取样涂布取样涂布 5.培养观察培养观察 6.菌落计数菌落计数从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土铲去表层土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将

14、样品装入事先准备好的信封中。准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要前都要灭菌灭菌。在每个稀释度下，在每个稀释度下，准备牛肉膏蛋白胨培养基（准备牛肉膏蛋白胨培养基（1个）和选择养基个）和选择养基(3个个)。制备制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基。个选择培养基。注：每个稀释度下需要注：每个稀释度下需要3个选择个选择培养基，培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。个牛肉膏蛋白胨培养基。稀释倍数为稀释倍数为103107。实验步骤实验步骤2.制备培养基制备培养基问题：问题：为什么分离不同的微生物要采为什么分离不同的微生物

15、要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的数量，选用的稀释范围相同吗？测定土壤中测定土壤中细菌细菌的数量，一般选的数量，一般选用用104、105和和106倍倍的稀释液进行平板的稀释液进行平板培养；测定培养；测定放线菌放线菌的数量，一般选用的数量，一般选用103、104和和105倍稀释；测定倍稀释；测定真菌真菌的数的数量，一般选用量，一般选用102、103和和104倍稀释倍稀释。注：注：样品的稀释样品的稀释 将将10g土样加入盛有土样加入盛有90mL无菌生理无菌生理盐水的锥形

16、瓶中盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有，转移至盛有9mL水的无菌试管中，水的无菌试管中，依次等比稀释至依次等比稀释至107稀释度，并按照由稀释度，并按照由107至至103稀释度的顺序分别吸取稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。序涂布平板，不必更换移液管。实验步骤实验步骤5.微生物的培养与观察微生物的培养与观察将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30下下培养。比较培养。比较牛肉膏培养基和选择培牛肉膏培养基和选择培养基养基中菌落的数量、形态等，并做中菌落的数

17、量、形态等，并做好记录。好记录。挑选选择培养基中不同形态的挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含菌落接入含酚红培养基酚红培养基的斜面中，的斜面中，观察能否变红。观察能否变红。不同种类的微生物，往往需要不不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般同的培养温度和培养时间。细菌一般在在3037的温度下培养的温度下培养12d；放线；放线菌一般在菌一般在2528的温度下培养的温度下培养57d；而霉菌一般在而霉菌一般在2528的温度下培养的温度下培养34d。注：注：一般来说，在一定一般来说，在一定的培养条件下的培养条件下(相同的培相同的培养基、温度及培养时间养基、温度及培养时间)，同种微生

18、物表现出稳定的同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落特征。EMB培养基与大肠杆菌代谢产物产培养基与大肠杆菌代谢产物产生紫色带金属光边的菌落生紫色带金属光边的菌落当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对下，至少对3个平板进行重复计数，然个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。释度计算出样品中细菌的数目。实验步骤实验步骤6.细菌的计数细菌的计数每克土壤样品菌数每克土壤样品菌数=某稀释倍数的某稀释倍数的菌落平均数稀释倍数细菌培养菌

19、落平均数稀释倍数细菌培养时所用的稀释液体积时所用的稀释液体积1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。用前都需要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。火焰旁操作。1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的

20、特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素CD3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M

21、3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）加入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐BC