现代分子生物学第五章课件.ppt
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- 现代 分子生物学 第五 课件
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1、第第 五五 章章 分子生物学基本研究法分子生物学基本研究法(上)(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术编辑ppt编辑ppt重组重组DNADNA操作过程示意图操作过程示意图编辑pptGregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt现代分子生物学的快速发展,得益于上个世现代分子生物学的快速发展,得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。因工程技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、分子的切割与连接、
2、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增扩增等,是分子生物学研究的核心技术。等,是分子生物学研究的核心技术。编辑ppt基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另的一部分,只不过
3、它强调了外源核酸分子在另一种寄主细胞中的繁衍与表达。一种寄主细胞中的繁衍与表达。编辑ppt事实上,这种跨越物种屏障、把来自其它生事实上,这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的生物细胞之中的能力,是物的基因置于新的生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。基因工程技术区别于其它技术的根本特征。DNA操作技术操作技术基因克隆的常用载体系统基因克隆的常用载体系统基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定编辑ppt5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件三大成就:三大成就:一、在一、在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携年代确定了遗传信
4、息的携带者、即基因的分子载体是带者、即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;质,解决了遗传的物质基础问题;二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制型和半保留复制机制,解决了基因的自我复解决了基因的自我复制和世代交替问题;制和世代交替问题;编辑ppt三、三、5050年代末至年代末至6060年代,相继提出了年代,相继提出了“中心法中心法则则”和操纵子学说和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。明了遗传信息的流动与表达机制。编辑ppt表表5-15-
5、1重组重组DNADNA技术史上的主要事件技术史上的主要事件年年 份份事事 件件1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶聚合酶I。1959-1960Ochoa发现发现RNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNA,并证明,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码;破译了第一个遗传密码;Jacob和和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和和B
6、renner等人证明,多肽链上的氨基酸等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由学家证明细菌的抗药性通常由“质粒质粒”DNA所决所决定。定。编辑ppt1966Nirenberg,Ochoa,Khorana,Crick等人破译了全部遗传密等人破译了全部遗传密码。码。1967第一次发现第一次发现DNA连接酶连接酶1970Smith,Wilcox和和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶,分离了第一种限制性核酸
7、内切酶,Temin和和Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer,Berg等人发展了等人发展了DNA重组技术,于重组技术,于72年获得第年获得第一个重组一个重组DNA分子,分子,73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等人发明了等人发明了DNA序列测定技术,序列测定技术,1977年完成了全长年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表
8、达的人脑激素和人胰岛素。岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和和Brinster获得转基因小鼠,获得转基因小鼠,Spradling和和Rubin得到得到转基因果蝇。转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物美、英批准使用第一例基因工程药物胰岛素,胰岛素,Sanger等人等人完成了入噬菌体完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。编辑ppt1983获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986GMO
9、首次在环境中释放。首次在环境中释放。1988Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧共体欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完 成 第 一 个 高 等 植
10、 物 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定完 成 第 一 个 高 等 植 物 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定((1.15108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定完成第一个人类基因组全序列测定(2.7109bp)。编辑ppt限制性核酸内切酶能够识别限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱上的特定碱基序列并从这个位点切开基序列并从这个位点切开DNA分子。分子。第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRI是是Boyer实验室在实验室在1972年发现的,它能特异性识别年发现的,它能特异性识别GAATTC序序列,将双链列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生分子在这个位点切开并产生具有粘性末
11、端的小片段。具有粘性末端的小片段。编辑ppt图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。编辑ppt图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 编辑ppt体外利用限制性核酸内切酶和体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进连接酶进行行DNA的切割和重组以后,还要将它们连接的切割和重组以后,还要将它们连接到具备自主复制能力的到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆分子就是分子克隆的载体(的
12、载体(vector)。病毒、噬菌体和质粒等)。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都是基因导入的载体。小分子量复制子都是基因导入的载体。编辑ppt获得了用外源获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成片段和载体分子重组而成的杂种的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为分子后,还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组才能保证重组DNA分子的增殖(图分子的增殖(图5-3)。)。编辑ppt图图5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 编辑ppt5.2 DNA操作技术操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自从琼脂糖(
13、自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来,)凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。琼脂,琼脂糖,聚丙烯酰胺,核酸,蛋白质?琼脂,琼脂糖,聚丙烯酰胺,核酸,蛋白质?编辑ppt 基基 本本 原原 理理一种分子被放置到电场中,会以一定的速度移一种分子被放置到电场中,会以一定的速度移向向适当的电极适当的电极,把这种电泳分子在电场作用下,
14、把这种电泳分子在电场作用下的迁移的迁移速度速度,叫做电泳的,叫做电泳的迁移率迁移率。它与电场强。它与电场强度和电泳分子本身所携带的度和电泳分子本身所携带的净电荷净电荷数成正比,数成正比,与片段大小成反比。与片段大小成反比。编辑ppt生理条件下,核酸分子中的磷酸基团呈离子生理条件下,核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态,所以,化状态,所以,DNA和和RNA又被称为多聚阴又被称为多聚阴离子(离子(polyanions),在电场中向正电极的),在电场中向正电极的方向迁移。方向迁移。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷
15、(几乎具有等量的净电荷(电电荷密度荷密度),因此它们能以同样的速度向正电),因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。极方向迁移。编辑ppt琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强,度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强,越适越适合分离小分子量的分子。合分离小分子量的分子。编辑ppt表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA
16、片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围(的大小范围(bp)0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501编辑ppt图图5-4 5-4 溴化乙锭溴化乙锭染料的化学结构染料的化学结构及其对及其对DNADNA分子的分子的插入作用。由于插入作用。由于插入了溴化乙锭插入了溴化乙锭分子,在紫外光分子,在紫外光照射下,琼脂糖照射下,琼脂糖凝胶电泳中凝胶电泳中
17、DNADNA的的条带便呈现出橘条带便呈现出橘黄色荧光,易于黄色荧光,易于鉴定。鉴定。编辑ppt图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 编辑ppt5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖,能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖,能在宿主细胞中长期保存下来,并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来,并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。编辑ppt细菌转化(细
18、菌转化(transformation),是指一种细菌菌),是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状而导致性状特征发生遗传改变的过程。特征发生遗传改变的过程。为提高效率,可对受体菌进行物理或化学处理,为提高效率,可对受体菌进行物理或化学处理,增加其获取增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞(被称作感受态细胞(competent cells)。)。编辑ppt图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 编辑pptCaCl2法法将快速生长期大肠杆菌置于经将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低预处理的低渗渗
19、CaCl2溶液中,细胞膨胀,膜通透性改变,溶液中,细胞膨胀,膜通透性改变,易与外源易与外源DNA相粘附。相粘附。将该体系转移到将该体系转移到42下做短暂的热刺激,外下做短暂的热刺激,外源源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上,筛选阳性克隆。细胞置于选择性培养基上,筛选阳性克隆。转化效率可达到转化效率可达到51062107个转化子个转化子/g超螺旋质粒超螺旋质粒DNA。编辑ppt电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷,形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷,形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加,大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加,大疏水性孔洞
20、会转变为亲水性孔洞,介质中的会转变为亲水性孔洞,介质中的DNA进入细进入细胞质。胞质。将生长至对数中期的将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至菌液冷却至4后后离心,洗菌后用离心,洗菌后用10%的甘油悬浮,将高密度的甘油悬浮,将高密度菌液(菌液(21010/ml)置于特制的电极杯中进)置于特制的电极杯中进行电击。行电击。编辑ppt获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为12.515kV/cm,时间跨度一般为,时间跨度一般为4.55.5毫毫秒。秒。电击转化与温度有关,一般在电击转化与温度有关,一般在04进行。进行。由于转化载体上
21、常带有由于转化载体上常带有LacZ基因,多用带有基因,多用带有不同抗生素(常用的抗生素包括氨苄青霉素、不同抗生素(常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等)的选择性培养基结合卡那霉素和四环素等)的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。编辑ppt利用噬菌体颗粒能够有效地将利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄注入到寄主细胞中这一特点,科学家又发明了重组体主细胞中这一特点,科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将表面的噬菌体接受器
22、位点将DNA注入受体细注入受体细菌,并在这些细胞中得到繁殖和表达。菌,并在这些细胞中得到繁殖和表达。编辑ppt图图5-6 噬菌体作为克隆载体构建基因文库的噬菌体作为克隆载体构建基因文库的流程图流程图 编辑ppt5.2.3聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)技术)技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用序列最常用的方法。的方法。PCR反应的模板反应的模板DNA若若是基因组上的某个片是基因组上的某个片段,就称为段,就称为genomic PCR,若若是是mRNA,反,反转录产生的转录产生的cDNA,就称为,就称为RT-PCR。编辑pptPCR技术的原理技术的原理首先将
23、双链首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链分离成两条单链DNA分子,分子,DNA聚合酶以单聚合酶以单链链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。编辑ppt DNA解链(变性)解链(变性)引物与模板引物与模板DNA相结合(退火)相结合(退火)DNA合成(链的延伸)三步。合成(链的延伸)三步。经不断重复循环之后,反应混合物中所含有的经不断重复循环之后,反应混合物中所含有的双链双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的
24、拷贝数,理论上的最高值应是区段的拷贝数,理论上的最高值应是2n。编辑ppt将含有待扩增将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高样品的反应混合物放置在高温(温(94)环境下加热)环境下加热1分钟,使双链分钟,使双链DNA变变性,形成单链模板性,形成单链模板DNA。降低反应温度(退火,约降低反应温度(退火,约50),约),约1分钟,分钟,使寡核苷酸引物与两条单链模板使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。将反应混合物的温度上升到将反应混合物的温度上升到72左右保温左右保温1-数分数分钟,在钟,在DNA聚合酶的作用下,从引物的聚合
25、酶的作用下,从引物的3-端加端加入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板分子按入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板分子按53方向延伸,合成新生方向延伸,合成新生DNA互补链。互补链。编辑ppt图图5-16 聚合酶链式反应示意聚合酶链式反应示意图。(图。(a)起始材料,双链)起始材料,双链DNA;(;(b)反应混合物加)反应混合物加热后发生链分离,降温使引热后发生链分离,降温使引物结合到待扩增靶物结合到待扩增靶DNA区段区段两端的退火位点上;(两端的退火位点上;(c)Taq聚合酶以单链聚合酶以单链DNA为模为模板在引物的引导下利用反应板在引物的引导下利用反应混合物中的混合物中的dNTPs合成互补合成互补的新链的新链
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