食品中微生物检测课件.ppt

1、第四十讲第四十讲 食品中微生物数量检测食品中微生物数量检测食品中微生物数量的检测方法食品中微生物数量的检测方法1）标准平板计数法）标准平板计数法Standard plate count,SPC）2）最近似数测定法（）最近似数测定法（most probable number,MPN）3）染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数）染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数4）显微镜直接计数法（）显微镜直接计数法（DMC）一、样品采集一、样品采集采样：指从待检物中采取少量具代表性的样品供分析检验用。1、采样要求、采样要求v（1）采样前，准备好灭菌的容器及采样工具；v（2）无菌采样；v（3）用无

2、菌纸袋或玻璃器皿存放样品；v（4）样品及时封口，并做好记录；v（5）及时送检。越快越好，一般越快越好，一般不得超过不得超过3h。2、采样原则：、采样原则：代表性代表性 防止污染防止污染3、采样的种类：、采样的种类：大样大样 一整批样品一整批样品 中样中样 200g 小样小样 分析的样品（检样）分析的样品（检样）25g（ml)4、采样方法：、采样方法：无菌操作无菌操作 采样用具必须无菌采样用具必须无菌 尽量采集有包装的食品；尽量采集有包装的食品；粉末状样品粉末状样品 边取样边混合边取样边混合 液体样品液体样品 边振摇边混合边振摇边混合 冷冻食品冷冻食品 保持冷冻状态保持冷冻状态 非冷冻食品非冷冻

3、食品 保存在保存在05 5、采样数量和部位：、采样数量和部位：200g/件件 乳制品乳制品 一瓶（个、罐、听）一瓶（个、罐、听）粮粮 三层五点（表、中、下）三层五点（表、中、下）油油 重点采取表层及底层油重点采取表层及底层油（1）面包、糕点、方便食品采集方法：v取原包装，用无菌镊子夹下包装纸采取外部及中心部位检样共200g，带馅糕点直接采取外皮与内陷25g。v（2）豆制品样品采集：采取接触盛器边缘、底部及上面不同部位样品200g放入灭菌容器内。v（3）乳及乳制品v散装或大型包装：用灭菌刀、勺取样，每件不少于200g，及时送检。v大型包装：采用整件原包装，每件样品采集量为瓶装：1瓶 袋装：1袋

4、罐装：1罐v（4）蛋及蛋制品样品采集：v鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂擦消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标记送检。v全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用75%酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双层螺旋式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋转收取检样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、下部取样，装入灭菌广口瓶中，每个检样不少于100克。v（5）肉及肉制品样品采集：v 肉类包括鲜肉、冻肉、肉馅、禽肉等，肉制品指火腿、香肠等。v生肉：宰后用无菌刀取两腿内侧肌肉各500克或劈半后两侧背最长肌各50克，立即送检。v家禽：用灭菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，四边各5cm2v其他熟制品：一般采20

5、0克。v（6）调味品样品采集：v酱油、食醋：瓶装 采取1瓶v 散装 无菌吸500mlv酱类 用灭菌勺子取500gv味精 采取一袋100gv（7）冷食品样品采集：v冷食菜：将样品混匀，采样200gv瓶装饮料：两瓶为一件 散装采500mlv冰淇凌：4杯为一件 散装采200g，放瓶内冷藏或隔热容器中v食用冰块：食用冰块取500g6、采样标签：名称、采样标签：名称 来源来源 数量数量 编号编号 时间时间.7、送检、送检 从采样到实验室越快越好，从采样到实验室越快越好，不得超过不得超过3h。（一）（一）传统的传统的SPC方法方法标准平板计数法（标准平板计数法（Standard plate count,S

6、PC）、平板菌落计数法）、平板菌落计数法意义：意义：判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态。长繁殖的动态。菌落总数：菌落总数：在一定条件下，每克（每毫升）样品中所含在一定条件下，每克（每毫升）样品中所含CFU（菌落形成单位）。（菌落形成单位）。测定方法：测定方法：检测样品的处理检测样品的处理 稀释稀释 倾注（涂布）平板倾注（涂布）平板 培养培养 计数计数 报告报告国标规定：国标规定：在需氧条件下：在需氧条件下：细菌细菌 NA 37 48h 霉菌霉菌 酵母酵母 PDA 2528 5天天二、二、检测方

7、法检测方法1、样品的预处理、样品的预处理（1）取样：无菌操作）取样：无菌操作 25g放入放入225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内灭菌生理盐水的无菌瓶内（1：10稀释液）稀释液）（2）均匀混合）均匀混合：均质器：均质器2、稀释、稀释1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1ml 3、倾注平板：稀释液移入平皿后，将稀释液移入平皿后，将46 的营养琼脂培养基注入平皿的营养琼脂培养基注入平皿约约15mL,转动平皿。转动平皿。空白对照空白对照4、倒置倒置 培养培养 琼脂凝固后，翻转平板琼脂凝固后，翻转平板 细菌细菌 37 48h 霉菌霉菌 2 8 5天天5、菌

8、落计数法、菌落计数法肉眼观察；放大镜；肉眼观察；放大镜；TTC（氯化三苯基四氮唑（氯化三苯基四氮唑)显色显色:培养基中加入培养基中加入 TTC作指示剂作指示剂,细菌细胞脱氢酶使其还原生成红色的不溶于水的三苯基甲簪细菌细胞脱氢酶使其还原生成红色的不溶于水的三苯基甲簪(TF)，使菌落中心产生红色。，使菌落中心产生红色。6、菌落计数的报告：、菌落计数的报告：报告单位：报告单位：cfu/g(mL)（1）平板菌落数的选择：平板菌落数的选择：细菌细菌30300；真菌；真菌30-100（2）稀释度的选择：）稀释度的选择：（3）菌落数的报告：）菌落数的报告：100以内时，以内时，按实数报告；按实数报告；大于大

9、于100时，两位有效数字如：时，两位有效数字如：16400 报告为报告为1.64104（二）旋转接种法（二）旋转接种法（Spiral plate method）原理：接种针将样品液以螺旋方式从平板中央往外连续接种。原理：接种针将样品液以螺旋方式从平板中央往外连续接种。接种量：接种量：0.05mL优点：可测定优点：可测定50500000cfu/mL的菌数；样品不需事先稀释；不需的菌数；样品不需事先稀释；不需做做2个重复；接种速度快；结果可人工计数，也可用激光计数器个重复；接种速度快；结果可人工计数，也可用激光计数器计数；人力与物力花费成本低廉；测定结果与传统方法相关性高计数；人力与物力花费成本低

10、廉；测定结果与传统方法相关性高。缺点：缺点：v设备投资较高设备投资较高v含颗粒样品容易堵塞管道含颗粒样品容易堵塞管道v如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降低如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降低v对琼脂平板表面要求高对琼脂平板表面要求高（三）膜过滤（三）膜过滤SPC方法的改良：过滤膜的孔径为方法的改良：过滤膜的孔径为 0.45um；收集菌体以提高检出率；收集菌体以提高检出率；直接显微计数；膜过滤与荧光染色方法结合；直接显微计数；膜过滤与荧光染色方法结合直接荧光膜技术计数法（直接荧光膜技术计数法（DEFT）Direct Epifluorescent Filter Technique：微菌落计

11、数，仅用于活细胞的检测。微菌落计数，仅用于活细胞的检测。原理：食品匀液经原理：食品匀液经DEFT膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至微菌落长出，显微镜观察微菌落长出，显微镜观察 G-3h G+6h。快速检测技术：特殊滤膜（快速检测技术：特殊滤膜（0.5um）过滤样品液）过滤样品液；滤膜经吖啶橙染；滤膜经吖啶橙染色；紫外光显微镜观察；色；紫外光显微镜观察；活细胞活细胞 橙色荧光橙色荧光 ；死细胞死细胞 绿色荧光绿色荧光 2030min（四）最近似数测定法（四）最近似数测定法（MPN）选择选择3个稀释梯度个稀释梯度的稀释液，的稀释液，每种稀释液每种稀释液接种接种

12、3管（管（5管）管）装有培装有培养基的试管中培养，根据实验结果查养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表检索表，得到样品中微生，得到样品中微生物数量。物数量。MPN的优点：方法相对简单；与的优点：方法相对简单；与SPC相比，相似率较高；用选择性相比，相似率较高；用选择性培养基可检测特殊的微生物类群；测定大肠菌群数量的方法。培养基可检测特殊的微生物类群；测定大肠菌群数量的方法。MPN的缺点：需要大量的玻璃器皿（特别是的缺点：需要大量的玻璃器皿（特别是5试管实验）；不能观试管实验）；不能观察微生物菌落的形态；准确性不高。察微生物菌落的形态；准确性不高。检验结果检验结果：用每用每100mL（g）

13、样品中大肠菌群最近似数来表示，）样品中大肠菌群最近似数来表示，简称大肠菌群简称大肠菌群MPN.亚甲基蓝（兰色）亚甲基蓝（兰色）白色白色刃天青（暗兰色）刃天青（暗兰色）粉红色或白色粉红色或白色染色还原的时间与样品中微生物浓度成染色还原的时间与样品中微生物浓度成反比反比两种染料：两种染料：（五）染色还原计数法（五）染色还原计数法一种估计一种估计活性微生物活性微生物数量的方法。数量的方法。原理：原理：活细胞内含有还原酶，可把活细胞内含有还原酶，可把特定的染料从一种颜色还原为另外一特定的染料从一种颜色还原为另外一种颜色。种颜色。应用：应用：乳品工业上原料乳中的微生物检测乳品工业上原料乳中的微生物检测优

14、点：优点：简便、快捷和经济简便、快捷和经济缺点：不同的微生物还原能力不同，给估算缺点：不同的微生物还原能力不同，给估算带来了一定的困难。带来了一定的困难。不适用于含有还原酶的食品不适用于含有还原酶的食品（六）显微直接计数法（六）显微直接计数法（Direct microscope count,DMC）一定量的食品（一定量的食品（0.1mL）涂布于载玻片（涂布于载玻片（1cm2）上）上烘干、固定、脱脂、染色烘干、固定、脱脂、染色显微镜计数，显微镜计数，用镜台测微尺用镜台测微尺计算出视野面积计算出视野面积则则 每每ml原原样样液含菌数液含菌数v =视野中平均菌数视野中平均菌数涂布面积涂布面积/视野面

15、积视野面积100 稀释倍数稀释倍数DMC方法的优点：方法的优点：快捷快捷、简便；、简便；能对细胞形态进行分析；能对细胞形态进行分析；载玻片易保存，作参考；载玻片易保存，作参考；可使用荧光技术增强效果。可使用荧光技术增强效果。缺点：仅适于检含大量菌体的样品；准缺点：仅适于检含大量菌体的样品；准确性差；易造成操作人员的疲劳。确性差；易造成操作人员的疲劳。（七）棉拭子涂抹法（七）棉拭子涂抹法 适于食品、食品、公共场所表层微生物的检测：公共场所表层微生物的检测：1）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（10mL试管）均匀涂试管）均匀涂抹样品表面一定面积（抹样品表面一定面积（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回）后，放回试管中，及时送检；试管中，及时送检；2）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中；）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中；3）按）按SPC方法进行梯度稀释、培养、计数。方法进行梯度稀释、培养、计数。