植物DNA分子标记课件.ppt

1、 分子标记的概念分子标记的概念u广义的分子标记广义的分子标记（molecular marker）：）：可遗传的并可检测的可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包序列或蛋白。包括蛋白质标记和括蛋白质标记和DNA标记（狭义的分子标标记（狭义的分子标记）。记）。u蛋白质标记包括动蛋白质标记包括动植物蛋白植物蛋白、同工酶同工酶及及 等位酶等位酶u理想的分子标记：理想的分子标记：1.高多态性高多态性 2.共显性遗传共显性遗传*3.能明确辨别等位基因能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组遍布整个基因组 5.无基因多效性无基因多效性 *6.检测手段简单快速检测手段简单快速 7.成本低廉成本低廉 8.重复性好重

2、复性好*杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性（codominance）*基因多效性（基因多效性（gene pleiotropism）：一个基因产生多种表型效应：一个基因产生多种表型效应的现象。的现象。DNA分子标记（分子标记（DNA molecular marker）直接）直接在在DNA分子水平上检测生物间的差异，是分子水平上检测生物间的差异，是DNA水平水平上遗传变异的直接反应。上遗传变异的直接反应。随着分子生物学技术的发展，现在随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、

3、基因组作技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。基因克隆等方面。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为非非PCR依赖的分子标记依赖的分子标记(基于基于Southern 杂交技术的杂交技术的分子标记分子标记)和和PCR依赖的分子标记依赖的分子标记。非非PCR依赖的分子标记依赖的分子标记(基于基于Southern 杂交技术的分子标记杂交技术的分子标记)包括：包括：u限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性标记 （restriction frag

4、ment length polymorphism,RFLP）u原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）PCR依赖的分子标记：依赖的分子标记：u随机扩增多态性随机扩增多态性DNA标记标记 （random amplification polymorphism DNA,RAPD）uDNA扩增指纹印记扩增指纹印记 （DNA amplification fingerprinting,DAF）u简单序列重复标记简单序列重复标记（simple sequence repeat,SSR）u随机引物聚合酶链式反应随机引物聚合酶链式反应 （arbitrarily primed PCR,AP-

5、PCR）u扩增片段长度多态性标记扩增片段长度多态性标记 （amplified fragment length polymorphism,AFLP）基于分子杂交技术的分子标记技术基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用此类标记技术是利用限制性内切酶解限制性内切酶解及及凝胶电凝胶电泳泳分离不同的生物分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记分子，然后用经标记的的特异特异 DNA 探针探针与之进行杂交，通过与之进行杂交，通过放射自放射自显影显影或或非同位素显色非同位素显色技术来揭示技术来揭示 DNA 的多态的多态性。性。分子杂交分子杂交：由具有互补碱基顺序的任何两：由具有互补碱基顺序的任何两

6、条条单链单链核酸分子片断形成核酸分子片断形成双链双链的过程。的过程。染色体原位杂交染色体原位杂交是指是指DNA探针与染色体上的探针与染色体上的DNA杂交，并在染杂交，并在染色体上直接进行检测的分子技术，其原理是两色体上直接进行检测的分子技术，其原理是两条核苷酸条核苷酸单链片断单链片断在适宜的条件下，通过在适宜的条件下，通过氢键氢键结合，形成结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA双键分子，用带有标记的双键分子，用带有标记的DNA或者或者RNA片片断作为核酸探针，与细胞内染色体杂交，用放断作为核酸探针，与细胞内染色体杂交，用放射自显影等方法予以显示，在荧光显微镜下观射自显影等方法

7、予以显示，在荧光显微镜下观察目的察目的mRNA或者或者DNA的存在与定位。的存在与定位。In situ hybridization For in situ hybridization,a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe,excess probe is washed away and the location of hybridized probe is examined.The technique enables the spatial localization of gene expression to

8、 be determined as well as the location of individual genes on chromosomes.bcdaFig.5 GISH images of chromosomes of tetraploid and diploid Festulolium progenies.The DNA of L.perenne was used as probe,and shown as blue color.The chromosomes of F.pratensis were shown as pale blue color.Translocation bre

9、akpoints are indicated in a and c by arrows.(a)Bx350-184,a 28-chromosome genome with at least 14 intergeneric translocations,some of which have two breakpoints in an arm(arrows).Bar:10 m.(b)Bx351-160,a 28-chromosome genome with intergeneric translocations.Bar:20 m.(c)Bx350-177 with fertile pollen,a

10、28-chromosome genome comprising approximately equal amount of Lolium and Festuca DNA with 9 intergeneric translocations,some of which have two breakpoints in an arm(arrows).Bar:20 m.(d)Prior-57,a 14-chromosome genome with intergeneric translocations.Bar:10 m.Guo et al.2005 RFLP标记：标记：限制性片段长度多态性限制性片段长

11、度多态性RFLP指应用特定的指应用特定的核酸内切酶核酸内切酶切割有关的切割有关的DNA分分子所产生的子所产生的DNA片段在长度上的变化。片段在长度上的变化。包括基因组包括基因组DNA限制性酶切，限制性酶切，Southern印记，印记，DNA探针制备，同位素探针制备，同位素/非同位素标记，非同位素标记，DNA分分子杂交等步骤。子杂交等步骤。生物能快速、精确地复制自身的生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几序列变异。如：碱基对的代换、缺失等

12、。几乎不可能有两个生物体乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。的碱基序列是相同的。限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解DNA长链，是识别长链，是识别DNA上的特上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对基对越少越少，DNA分子中被识别的位点分子中被识别的位点越多越多，所产生的，所产生的限制片段限制片段越短越短。来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种但是在不同物种、不同品种、甚至同一品

13、种的不同的两个个体之间，的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了从而产生了限制片段长度限制片段长度的的多态性多态性。用限制性酶来酶解植物核用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。进行进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与印迹

14、转移操作，用特定的探针与滤膜上的滤膜上的DNA杂交，经过杂交，经过放射自显影放射自显影就能检测就能检测到高等植物核到高等植物核DNA的的RFLP。0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb(1)0.3kb0.4kb0.5kb(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系20.4kb0.1kb+RFLP标记方法与步骤标记方法与步骤（1）DNA的分离：可用的分离：可用CTAB法或法或SDS法法（2）酶切：一般根据基因组总）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选的复杂性选 用限制酶。用限制酶。（3）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳（4）Southern印迹转移印迹转移（5）DNA杂交及放射自显

15、影杂交及放射自显影RFLP标记优点标记优点 （1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组）不受性别、年龄局限，不会受表达的组 织、发育阶段或外界环境的不同而受影织、发育阶段或外界环境的不同而受影 （2）标记座位的等位基因间是）标记座位的等位基因间是共显性共显性的，通过的，通过 杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性 纯合子纯合子 （3）RFLP标记源于基因组标记源于基因组DNA自身变异，在自身变异，在 数量上几乎不受限制。数量上几乎不受限制。RFLP标记缺点标记缺点（1）DNA需要量大。需要量大。（2）所需仪器较多）所需仪器较多（3）技术较为复杂）技术较为复杂（4

16、）多数）多数RFLP表现为二态性，提供的信息量较表现为二态性，提供的信息量较低低（5）与内切酶选用密切相关）与内切酶选用密切相关RAPD标记标记 1990年，年，美国杜邦公司美国杜邦公司科学家科学家Williams推出。推出。RAPD方法是在方法是在PCR技术基础上发展起来的，技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为它利用一系列单个随机引物（通常为10个核个核苷酸），对所研究的基因组苷酸），对所研究的基因组DNA进行进行PCR扩扩增，引物与基因组增，引物与基因组DNA某一区段互补时，就某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游与其结合，就可对引物下游DNA进行合成，进行合成，即扩

17、增。即扩增。RAPD的基本概念和原理的基本概念和原理RAPD的引物：的引物：（1）为随机引物）为随机引物（2）序列较短（通常为）序列较短（通常为10个核苷酸）个核苷酸）（3）为一个寡核苷酸单链引物）为一个寡核苷酸单链引物0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系2RAPD的基本实验程序的基本实验程序1.DNA的提取的提取2.模板模板DNA浓度和质量的检测浓度和质量的检测3.PCR扩增扩增4.电泳检测：电泳检测：PCR结束后每个样品加结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲凝胶上样缓冲液，每个泳道点样液，每个泳道点样20ul。5.将凝

18、胶浸于将凝胶浸于1ug/ml的的EB中中30min60min，用水清洗，用水清洗约约10min，观察、拍照。，观察、拍照。6.统计分析：记录条带清晰的统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相条带，计算带纹相似率；计算带频率、群内遗传纯度；似率；计算带频率、群内遗传纯度；DNA片段大小。片段大小。Timothy genetic variation(Guo et al.2002)RAPD的优缺点的优缺点优点：优点：（1）不需）不需DNA探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖整个基因组。具有广泛适用性和通用性。整个基因组。具有广泛适用性和通用性。（2）用一个

19、引物可扩增出多片段。）用一个引物可扩增出多片段。（3）技术简单，需要样品量少，成本低。）技术简单，需要样品量少，成本低。（4）每个）每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，标记相当于基因组分析中的靶序列位点，简化信息的转移过程。简化信息的转移过程。（5）可以对）可以对RFLP难以分析的基因组区域做遗传连锁图。难以分析的基因组区域做遗传连锁图。（6）分析自动化。）分析自动化。RAPD的优缺点的优缺点缺点：缺点：（1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。（2）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、Mg 2+浓度，

20、浓度，PCR反应中条件的变化等。反应中条件的变化等。（3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段 不一定同源；一条带可能包含不同的产物。不一定同源；一条带可能包含不同的产物。AFLP标记标记 AFLP：扩增片段长度多态性：扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism）AFLP技术是技术是1992年由荷兰年由荷兰Keygene公司的科学家公司的科学家Zabeau Mare和和Vos Pieter发明并发展起来的一种发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。选择扩增限制酶切片段的方法。AFLP的基

21、本原理的基本原理植物基因组植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后扩增，最后通过通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。分离扩增的特异限制性片段。在不需在不需要要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。次单个反应中检测到大量的片段。AFLP的基本原理的基本原理

22、AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为度为1820个核苷酸。引物主要由个核苷酸。引物主要由3部分组成：部分组成：（1）核心序列核心序列（CORE），该序列与人工接头互补；），该序列与人工接头互补；（2）限制性内切酶识别）限制性内切酶识别特异序列特异序列（ENZ）；）；（3）选择性）选择性延伸序列延伸序列（EXT），即引物），即引物3端的选择碱端的选择碱基，选择碱基延伸到基，选择碱基延伸到酶切片段区酶切片段区。如：如：EcoRI引物和引物和MseI引物引物EcoRI 5 -GACTGCGTACC AATTC NNN-3 MseI 5 -GAT

23、GAGTCCTGAG TAA NNN-3COREENZEXTAFLP的优缺点的优缺点 优点：优点：（1）少量引物可获得较多标记，）少量引物可获得较多标记，50150条带条带（2）多为显性标记或共显性标记，受环境影响）多为显性标记或共显性标记，受环境影响 小，小，无复等位效应无复等位效应（3）带型清晰，具高分别率）带型清晰，具高分别率（4）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带纹丰富，灵敏度高，重复性好纹丰富，灵敏度高，重复性好（5）不需事先知道）不需事先知道DNA序列信息序列信息 缺点：操作复杂，费用较高缺点：操作复杂，费用较高SSR标记标记pS

24、SR：简单重复序列（：简单重复序列（simple sequence repeat）多）多态性，也叫微卫星标记。态性，也叫微卫星标记。p微卫星：即短串联重复微卫星：即短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)，它是由，它是由2-6bp重复单位构成的重复单位构成的DNA序列，通常序列，通常多态性片段长度在多态性片段长度在100-300bp。以人类基因组为例，平。以人类基因组为例，平均每均每15-20kb就存在就存在1个个STR座位，据此估计整个人类座位，据此估计整个人类基因组中大约有基因组中大约有50,000-100,000个个STR位点。由于微卫位点。由于微卫星星DNA具有高度

25、的多态性和遗传稳定性，所以非常适具有高度的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学合作为遗传学DNA分子标记。分子标记。真核生物基因组中散布着大量的微卫星真核生物基因组中散布着大量的微卫星DNA，微卫星，微卫星DNA由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为26bp，一个，一个SSR总长度可达几十到几百总长度可达几十到几百bp。许多。许多微卫星间的不等交换或复制过程中的微卫星间的不等交换或复制过程中的DNA滑动而高滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性多态性。正。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列

26、两端因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的可检测到简单重复序列单位数不同的DNA区域多态区域多态性。性。Bx 351-241(2n)Bx 351-229(2n)Bx 351-200(2n)Bx 351-231(2n)Bx 351-217(2n)Bx 351-238(2n)Bx 351-175(4n)Bx 351-214(4n)Bx 351-185(4n)Bx 351-184(

27、4n)Bx 351-267(4n)Bx 351(wt,4n)D-12(parental line)Tomosakae(parental line)NC105150250bpFig.6 SSR profiles of Festulolium progenies with primer LPSSR K10F08 showed amplified polymorphism among the diploid and tetraploid Festulolium progenies and showed two tetraploid-specific band of 110 bp and 115 bp

28、(arrows)which also appeared in the amphidiploid Festulolium wild type plant(2n=4x=28)and putative parental D-12(Lolium perenne)plant,respectively.NC,negative control.RFLPRAPDAFLPSSRSNP遗传特性遗传特性共显性共显性显性显性显性显性/共显共显性性显性显性显性显性/共显共显性性多态性多态性低低中等中等高高高高低低检测基础检测基础分子杂交分子杂交随机随机RCP专一专一PCR专一专一PCR专一专一PCR检测基因组检测基因组

29、部位部位单单/低拷贝低拷贝整个基因整个基因组组整个基因整个基因组组重复序列重复序列区区整个基因组整个基因组技术难度技术难度难难易易易易易易易易DNA质量质量高高低低低低低低低低DNA用量用量510g50ng50ng50ng50ng使用同位素使用同位素是是否否是是/否否否否否否探针探针DNA短片段短片段 随即引物随即引物专一引物专一引物专一引物专一引物专一引物专一引物费用费用中等中等低低高高高高高高 标记系统在应用时的选择标记系统在应用时的选择分子标记的应用分子标记的应用 分子标记遗传图谱的构建和基因定位分子标记遗传图谱的构建和基因定位 分子标记对质量性状的基因定位分子标记对质量性状的基因定位

30、数量性状基因位点（数量性状基因位点（QTL）分子标记对定）分子标记对定位的研究位的研究 分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种 比较基因组分析比较基因组分析 分子标记用于种质鉴定的研究分子标记用于种质鉴定的研究基因芯片技术和应用基因芯片技术和应用概念：采用原位合成或直接点样的方法将概念：采用原位合成或直接点样的方法将大量大量DNA片段片段或或寡核苷酸片段寡核苷酸片段以预先设计的方式排列在以预先设计的方式排列在硅硅片、玻璃等介质片、玻璃等介质上形成上形成微矩阵微矩阵，待检测样品用荧，待检测样品用荧光分子标记后，与微矩阵杂交，通过光分子标记后，与微矩阵杂交，通过荧光扫描及荧光扫描及计算机分析计算

31、机分析即可获得样品中大量的即可获得样品中大量的基因序列基因序列及及表表达信息达信息，以达到快速、高效、高通量的分析生物，以达到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。信息的目的。基因芯片技术和应用基因芯片技术和应用按载体材料分：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片按载体材料分：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片按点样方式分：原位合成芯片、微矩阵芯片、按点样方式分：原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片电定位芯片按按DNA种类分：寡核苷酸芯片、种类分：寡核苷酸芯片、cDNA芯片芯片按用途分：表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱按用途分：表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片等。芯片、测序芯片和毒理芯片等。

32、基因芯片技术和应用基因芯片技术和应用 实验操作：实验操作：准备探针：准备探针：RNA提取提取标记标记荧光染料荧光染料p 杂交反应杂交反应p 杂交后的处理杂交后的处理p 实验设计：异种实验设计：异种DNA平行试验；平行试验；RNA质量质量 检测对照；封闭对照；规整化对照检测对照；封闭对照；规整化对照p 成像分析成像分析Gene chip基因芯片技术和应用基因芯片技术和应用基因芯片的应用：基因芯片的应用：基础医学研究；药物筛选；临床诊断；指导用药；基础医学研究；药物筛选；临床诊断；指导用药；预防医学研究；环境保护；军事、司法；农业等预防医学研究；环境保护；军事、司法；农业等基因芯片使用应注意的问题：基因芯片使用应注意的问题：类型的选择；基因芯片数量；取材；取材量；结类型的选择；基因芯片数量；取材；取材量；结果分析；多种芯片结合应用果分析；多种芯片结合应用