微生物标本处理及接种课件.ppt

1、微生物检验标本采集与接种内容血培养尿培养痰培养脓液脑脊液前列腺STD厌氧培养血培养增菌培养商品血培养瓶 成人瓶、儿童瓶、中和抗生素瓶无菌操作采集血标本接种到培养瓶后，轻轻混匀以防血液凝固。立即送检，切勿冷藏。采血量成人采血量是1020ml，儿童15ml。血液和肉汤之比为1:51:10。35 培养5-7天体积体积%阳性血培养结果阳性血培养结果 vs.采集的套数采集的套数%99%89%80%真阳性真阳性20 ml/套套Mayo Clinic Study用于培养的血液体积用于培养的血液体积 体重 磅 千克体积(ml)/穿刺总量/2次穿刺1%全血体积%总血液体积195天天由如下微生物引起的可疑的败血症

2、或心内膜炎:霉菌(组织胞浆菌,镰刀菌,等等秕糠马拉癣菌 军团菌属巴尔通体新型隐球菌Q-热惠普尔病支原体属其他病原菌 3 分离管分离管咨询咨询ID医生医生血清血清Ag凝集凝集+分离培养分离培养干预措施可以减少导管相关性感染干预措施可以减少导管相关性感染 手消毒手消毒 用洗必泰进行皮肤消毒用洗必泰进行皮肤消毒 在穿刺过程中完全无菌操作在穿刺过程中完全无菌操作 锁骨下静脉穿刺锁骨下静脉穿刺 移去不必要的中央静脉插管移去不必要的中央静脉插管血管内导管相关性感染预防指南血管内导管相关性感染预防指南.MMWR Recom Rep 2002:51(RR10)1-29尿道感染尿道感染每年每年850万例尿路感染

3、万例尿路感染,90%为女为女性性1/2.5个妇女在一生中会得个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流下行性感染：血流肾脏肾脏膀胱（金膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道上行性感染：尿道膀胱膀胱肾肾盂盂 血流血流Anatomy of Urinary Tract尿路的解剖图尿路的解剖图侧面图膀胱耻骨子宫颈尿道输卵管卵巢子宫阴道直肠肛门综合病症综合病症尿道炎或急性尿路综合征尿道炎或急性尿路综合征膀胱炎膀胱炎-膀胱的炎症膀胱的炎症肾盂肾炎肾盂肾炎-肾脏的炎症肾脏的炎症 Age年龄年龄 5 10 20 30 /60有症状的有症状的无症状的无症状的

4、尿路感染病原菌尿路感染病原菌大肠埃希菌与膀胱上皮细胞相互作用大肠埃希菌与膀胱上皮细胞相互作用伞状粘附伞状粘附膀胱上皮细胞膀胱上皮细胞尿液运输方法尿液运输方法无需冷藏无需冷藏 有症状妇女的尿路感染诊断性试验有症状妇女的尿路感染诊断性试验尿液革兰染色尿液革兰染色-革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌传统的尿培养传统的尿培养使用校准过的接种环使用校准过的接种环(0.001 or 0.01 ml)垂直插入装有尿液的无菌容器中垂直插入装有尿液的无菌容器中 在琼脂平板上分区划线：血平皿，麦康凯平皿或在琼脂平板上分区划线：血平皿，麦康凯平皿或CLED平皿平皿大多数尿路病原菌能在血平皿上生长大多数尿路病原菌能在血平皿上生

5、长麦康凯平皿有鉴别功能，为革兰阴性杆菌的选择性培养基麦康凯平皿有鉴别功能，为革兰阴性杆菌的选择性培养基尿培养的划线方式尿培养的划线方式第一区第一区=50,000 cfu/ml第二区第二区=75,000 cfu/ml第三区第三区=100,000 cfu/ml沿中心线向下沿中心线向下=50,000 cfu/ml长向边缘长向边缘=100,000 cfu/ml尿培养的培养基尿培养的培养基5%血平皿（美国用羊血，欧洲用马血）血平皿（美国用羊血，欧洲用马血）伊红美兰平皿（伊红美兰平皿（EMB）大肠埃希菌为金属绿）大肠埃希菌为金属绿麦康凯平皿麦康凯平皿 LF vs NLF 胱氨酸胱氨酸-乳糖乳糖-低电解质平

6、皿（低电解质平皿（CLED）显色平皿显色平皿(BBL公司的公司的CHROMagar，Hardy BluEcoli Biplate)CUTI（Oxoid公司）公司）;CPSID2（生物梅里埃公司）（生物梅里埃公司）;UriSelect（Biorad公司）公司）;Rambach;others蛋白胨，酵母提取物，色原物蛋白胨，酵母提取物，色原物科玛嘉显色培养基（科玛嘉显色培养基（BBL）大肠埃希大肠埃希菌菌肠球菌肠球菌无乳链球菌无乳链球菌腐生葡萄球菌腐生葡萄球菌同样的接种物在同样的接种物在科玛嘉显科玛嘉显色培养基（色培养基（BBL）上）上生长生长大肠埃希菌，肠球菌和变大肠埃希菌，肠球菌和变形杆菌在血

7、平皿上生长形杆菌在血平皿上生长CHROMagar Orientation(BBL)chromID CPS-生物梅里埃公司的产品快速鉴定大肠埃希菌，变形杆菌和肠球菌可分离所有尿道病原菌更好的可操作性更好的鉴定能力更高的可靠性尿培养【操作步骤操作步骤】1培养皿放置至室温，先充分摇匀尿液2用1l定量接种环或用微量移液器无菌吸取10ul尿液接种于羊血平皿和MAC上，然后用无菌接种环划线涂布，置35，最好在510co2环境下，孵育1824小时3次日观察结果，根据诊断标准进行诊断，阳性结果做细菌鉴定和药敏。尿培养【定量标准定量标准】用1l接种环，结果1000cfu/ml；用10l接种环，结果100cfu/

8、ml。菌计10万cfu/ml，继续鉴定和药敏。降低标准的情况：幼儿、儿童或男性的确定的尿路感染，其尿标本定量也可10万cfu/ml；插导管的患者、最近用过抗生素者、大量喝水者、伴发脓尿和有症状者、有尿路阻塞或由于血源性传播而患有肾盂肾炎者，其尿标本定量也可10万cfu/ml；患有尿道综合征的性活跃的年轻女性，其尿标本定量也可100cfu/ml。评价尿培养的标准评价尿培养的标准病人标本特征有意义的菌落形成单位/ml（非皮肤污染）无症状者清洁留取100,000有症状者，不固定的清洁留取10,000 1-2种机会致病菌。若多于2种则认为尿液被污染有症状者，性活跃女性清洁留取100个纯菌落肠杆菌科菌男

9、性清洁留取1000个机会致病菌任何人内置导尿管100,000任意数量机会致病菌任何人通过直接导管获得100任意数量机会致病菌任何人通过外科手术从肾脏获得任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人Percutaneous bladder tap经皮膀胱吸取任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人Any任何标本任何数量金黄色葡萄球菌不同人有争议任何数量的酵母菌尿培养尿培养-注意事项注意事项标本留取严格执行无菌操作。不要将尿液标本接种于增菌肉汤培养基中。清洁中段尿标本不要进行离心处理。尿液标本原则上不做厌氧培养。尿液收集后应立即送检，不能送检者可置48冰箱储藏，储存时间24小时。患者应在用药前或停用抗生素后至少三

10、天留取尿液，尿液中勿加防腐剂。痰培养痰培养-操作步骤操作步骤取适量痰液化剂放入痰标本盒内混匀放置30分钟，用无菌环挑23环标本，分区划线接种于羊血平皿或沙保培养基上、Mac置35孵育1824小时,巧克力平板5co2 35孵育1824小时。观察结果，根据细菌生长情况进行鉴定及药敏。挑取脓液部分涂片，革兰染色镜检。判断标本是否合格。痰培养痰培养-操作步骤操作步骤痰标本涂片染色显微镜检查的分类：判断标痰标本涂片染色显微镜检查的分类：判断标准准比较简单的方法就是确定鳞状上皮细胞数量：细胞数 10/低倍视野，说明混有痰液。细胞数/低倍视野WBC 10 鳞状上皮细胞25 不合格WBC 1025 鳞状上皮细

11、胞 25 不合格WBC 25 鳞状上皮细胞 25 不合格WBC 25 鳞状上皮细胞1025 可接受WBC 25 鳞状上皮细胞10 合格WBC 25 鳞状上皮细胞25 可接受?用革兰氏染色来评估呼吸道标本是用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格否合格10鳞状上皮细胞鳞状上皮细胞/LPF拒收！拒收！弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本上皮细胞少，有代表性的好标本形态学鉴别要诀形态学鉴别要诀球菌球菌革兰阴性双球菌革兰阴性双球菌肾型豆子样，平肾型豆子样，平行纵轴排列行纵轴排列=奈瑟菌属奈瑟菌属革兰阳性双球菌革兰阳性双球菌拉长，单个纵轴拉长，单个纵轴，末端呈

12、点状（柳叶刀状），末端呈点状（柳叶刀状）=链球菌链球菌（肺炎链球菌）（肺炎链球菌）实际革兰氏染色实际革兰氏染色革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌物中提示为卡他莫拉菌物中提示为卡他莫拉菌革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌形态学鉴别要诀形态学鉴别要诀球菌球菌革兰阳性球菌成对，成链革兰阳性球菌成对，成链较小、较小、拉长的、从不拉长的、从不4联排列联排列=链球菌属链球菌属革兰阳性球菌呈堆排列，通常很圆，细胞较革兰阳性球菌呈堆排列，通常很圆，细胞较大，不拉长，可成对，但链不超过大，不拉

13、长，可成对，但链不超过4个细胞个细胞。可能因脱色过度呈革兰阴性。但如果不是。可能因脱色过度呈革兰阴性。但如果不是肾型话不可能为革兰阴性菌。肾型话不可能为革兰阴性菌。链状的革兰阳性球菌：提示链链状的革兰阳性球菌：提示链球菌球菌短链，短链，6个个细胞）提示化脓链球菌或草绿色链球细胞）提示化脓链球菌或草绿色链球菌菌革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌更多的革兰氏染色形态学更多的革兰氏染色形态学呈堆或四呈堆或四联排列的联排列的革兰阳性革兰阳性球菌提示球菌提示葡萄球菌葡萄球菌革兰阳性杆菌的形态学鉴别要诀革兰阳性杆菌的形态学鉴别要诀革兰氏阳性杆菌可以很规则，如果是需氧菌则非常可能革兰氏阳性杆菌可以很规则，如果是需

14、氧菌则非常可能是芽胞杆菌属，如果是厌氧则非常可能是梭菌属。如果是芽胞杆菌属，如果是厌氧则非常可能是梭菌属。如果很小，可能是不呈链状的李斯特菌属，如果呈链状则很很小，可能是不呈链状的李斯特菌属，如果呈链状则很可能是乳酸杆菌属。可能是乳酸杆菌属。革兰阳性不规则的杆菌（多形态），一端比另一端粗革兰阳性不规则的杆菌（多形态），一端比另一端粗。常相互吸附或呈篱笆样排列。常相互吸附或呈篱笆样排列=棒状杆菌属或丙酸杆棒状杆菌属或丙酸杆菌属菌属细胞内细菌细胞内细菌革兰阴性双球菌革兰阴性双球菌多形态提示混合厌氧菌感染多形态提示混合厌氧菌感染外型奇特的酵母菌，不像米老鼠的耳朵或白色念珠菌椭外型奇特的酵母菌，不像米

15、老鼠的耳朵或白色念珠菌椭圆形孢子。报告圆形孢子。报告“真菌成分和酵母样细胞真菌成分和酵母样细胞”。不要遗忘。不要遗忘革兰阴性杆菌。革兰阴性杆菌。痰培养痰培养-特别提醒特别提醒洋葱伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌是一种重要的呼吸道致病原，可引起囊性纤维化。常规培养基中生长良好。诺卡菌（诺卡菌（Nocardia spp）诺卡菌是一种重要的呼吸道致病菌。培养的标本应立即进行实验室检查，如果延迟时间不长，4保存也可以接受。标本革兰染色检查，可以发现小的革兰阳性菌，外观呈分枝状、丝状或球状。没有特异的培养诺卡菌的培养基，可用心浸液沙氏葡萄糖琼脂、脑心浸液琼脂、羊血琼脂或胰蛋白大豆琼脂。25-37孵育3周，3

16、7更好。鼻咽部金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌确定金黄色葡萄球菌带菌者，用聚酯头拭子从前鼻孔取鼻咽分泌物，接种5羊血，35孵育2d。痰培养痰培养-特别提醒特别提醒鼻咽部脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌采集鼻咽拭子标本，接种血琼脂、巧克力琼脂或MTM培养基，5CO2的潮湿环境，35孵育72h。喉A群链球菌群链球菌喉部标本最常用于诊断A群链球菌喉炎，标本接种血琼脂510CO2环境，35孵育48h。脑脊液-操作步骤操作步骤将脑脊液标本经离心（1500g，15min）后，将上清液倒入消毒的试管，留下0.5ml沉淀和液体，充分混匀。无菌吸取标本2030ul分别划线接种于羊血平皿、巧克力平皿，分别置烛缸和普通培养箱内

17、35孵育2448小时。应同时制备涂片，革兰染色镜检。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。脑脊液-操作步骤操作步骤也可将脑脊液标本注入增菌培养瓶内先行增菌培养，具体操作参见血液培养。采集CSF是为了诊断脑膜炎，细菌性脑膜炎分为急性和慢性两种。急性脑膜炎在感染后24h内产生症状，通常由化脓性细菌引起，最可能的病原菌根据患者年龄和疾病是否由社区或医院感染而有变化。包括：B群链球菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等。慢性脑膜炎（症状持续至少4周）的典型致病菌包括：结核分枝杆菌、梅毒螺旋体、布鲁氏菌、问号钩端螺旋体和博氏疏螺旋体。脑脊液离心涂片抗酸染色，应用30003600g

18、30min。厌氧菌很少引起脑膜炎，因此不需要对脑脊液常规进行厌氧菌培养。厌氧菌常与脑脓肿形成、硬脑膜下积脓和硬脑膜外脓肿有关。脓液培养-标本要求标本要求临床医生根据需要无菌操作取材，比较理想的方法是用注射器抽取脓性物质。从脓肿底部或脓肿壁的取样，效果最好。如果不能获得抽取物，也可以用拭子从伤口深处采集渗出物，至少采集两个拭子，一个用于涂片染色，一个用于培养。厌氧培养最好不用拭子。将采集的标本置于无菌试管内，立即送检。厌氧培养标本取材应迅速、准确，禁止接触空气，盛标本容器内要排尽空气脓液培养【标本处理标本处理】标本划线接种于羊血平皿，35孵育2448小时。同时涂片革兰染色。厌氧培养接种布氏血琼脂

19、，厌氧环境培养。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。前列腺培养【标本要求标本要求】首先用无菌等渗盐水的拭子洗净尿道口。由临床医生行前列腺按摩术留取标本于无菌试管内，立即送检。【标本处理标本处理】将标本划线接种于羊血平皿，35孵育2448小时。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。【注意事项注意事项】留取标本注意避免污染。疑为性传播疾病做相应的STD培养。淋球菌培养【操作步骤操作步骤】待检物划线接种于专用MTM平皿上，将接种好的平皿置烛虹中置35温箱孵育48小时；取出平皿，挑取可疑菌落进行鉴定；鉴定：涂片革兰染色；氧化酶试验；内酰胺酶试验；生长试验；糖发酵试验。支原体培养从410 冰箱

20、中取出所需数量地培养基瓶，恢复液及鉴别、定量、药敏板，使其在接种前接近室温。旋下外盖，取下丁基橡胶内塞，然后挤滴加入恢复液，培养基迅速融解、表面至标签上缘处（约1.8ml）应随即、直接往培养基瓶接种标本（如果延迟接种，则标本置室温不超过2小时；在410 时不超过8小时）混匀后，从瓶内分别取50微升（1大滴）加到鉴别、定量、药敏板的每一小孔中然后，在每孔正中上方，准确、挤滴加入一滴石蜡油。将鉴别、定量、药敏板置36 孵育箱中培养12小时后，即可开始观察结果;不见阳性者，则连续培养时间应延长至48小时结束。临床细菌室厌氧菌培养基本临床细菌室厌氧菌培养基本程序程序厌氧培养基本设备厌氧标本采集和运送步

21、骤厌氧菌的分离和鉴定步骤厌氧菌的报告厌氧菌的药敏试验厌氧菌的菌种保存厌氧培养基本设备厌氧培养基本设备输送琼脂输送琼脂 AmiesAmies琼脂琼脂 (41998(41998、41999)41999)难辩梭菌琼脂难辩梭菌琼脂(43213)(43213)厌氧培养基厌氧培养基厌氧培养装置厌氧培养装置 厌氧气袋厌氧气袋 厌氧盒或厌氧罐厌氧盒或厌氧罐 厌氧培养箱厌氧培养箱厌氧菌鉴定方法厌氧菌鉴定方法需要准备的厌氧菌培养基需要准备的厌氧菌培养基斯氏琼脂+5%羊血：适用所有厌氧菌生长斯氏万古霉素+5%羊血：适用革兰阴性厌氧菌难辩梭菌选择培养基(CCFA)：分离难辩梭菌改良厌氧血平皿改良厌氧血平皿配制改良厌氧

22、血平皿配制血琼脂基础 (按1000ml量）半胱氨酸：0.4克氯化血红素(5mg/ml):1ml1%维生素K1:0.1ml 加热溶解冷却后调整pH7.4 高压灭菌后冷却至50时加入5-10%的脱钎维羊血 混合后倾注平皿。营养好可供大多数厌氧菌生长质量控制：产黑色素普雷沃菌形成典型菌落和色素 产气夹膜梭菌有双圈溶血。厌氧标本的选择、采集和运送厌氧标本的选择、采集和运送可疑厌氧菌感染特征感染局部产生气体分泌物有恶臭分泌物带血或呈黑色粘膜周围的感染 如肛周、口腔、鼻窦、咽颊等细菌培养阴性，但有菌血症表现长期使用氨基糖苷类抗生素，但无效者有基础疾病免疫低下者需做厌氧血培养的高危人群需做厌氧血培养的高危人

23、群肠脓毒症、女性生殖道感染、褥疮及呼吸道感染患者ICU患者或近期做过腹部外科手术的患者严重烧伤和外伤患者伴有严重心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、移植和免疫抑制患者老年患者临床高度怀疑有厌氧菌感染的患者 绝大多数住院患者需要做厌氧血培养绝大多数住院患者需要做厌氧血培养正确地收集标本正确地收集标本不能做厌氧培养的标本：咽、鼻、尿道或直肠拭子。咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物排出或导出的尿及胃内容物。粪便（除难辨梭菌）可做厌氧培养的标本可做厌氧培养的标本从未开放的脓肿抽取脓液尿：从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出 从肾造口管收集的气管切开吸取的肺分泌物女性生殖器：后穹隆穿刺穿刺抽出的胸腔液、腹腔液、脑脊液窦

24、道标本：可插入小导管用注射器吸出窦道损伤部位取材做活组织检查床边采集标本的步骤床边采集标本的步骤除去表面陈旧的脓和分泌物,从深处采取首先接种在厌氧培养基,立即置厌氧容器内同时撕开并放入产气袋,放指示剂立即盖好盖或封好厌氧袋口剩余部分标本种需氧培养基剩余最后标本作两张涂片到达实验室后，35度孵箱培养无菌体液无菌体液直接种入厌氧血培养瓶同时种普通血培养瓶厌氧菌分离的基本分离步骤厌氧菌分离的基本分离步骤第一次耐氧试验:初始标本需氧和厌氧对照 发现可疑菌落(需氧环境不生长菌落)第二次耐氧试验:多个可疑菌落分别接种需氧和厌氧平皿,分别置35度作需氧和厌氧培养.第三次耐氧试验:取仅厌氧环境生长菌落进行厌氧

25、和需氧培养 如分离的菌落仅在厌氧环境生长,可确定为厌氧菌.重要的提示重要的提示做耐氧试验时，原始平板不要丢弃，继续厌氧培养某些厌氧菌生长缓慢一旦厌氧试验失败（操作误差等），有备份菌株厌氧菌的鉴定厌氧菌的鉴定I级实验室应达到的标准：根据耐氧试验结果，革兰染色，菌落特点 提供厌氧菌初步推断报告。II级实验室应达到的标准：根据革兰染色反应，镜下形态，菌落形态，耐氧试验 用自制或国产传统生化反应试剂定种III级实验室应达到的标准：能采用国际公认标准化鉴定系统 如API-20A、Micro ID、Vitek-ANI 气-液相色谱仪厌氧菌的药敏试验厌氧菌的药敏试验厌氧菌感染以经验用药为主：厌氧菌对现已上市的药物的敏感性有合理的预测性药敏试验报告时间太长（46天）厌氧菌药敏试验指征：严重感染 （心内膜炎、脑脓肿、骨髓炎治疗时期长）观察药物敏感性变化 经验用药无效 对新药评价 耐药监测目前可推荐的厌氧菌药敏方法目前可推荐的厌氧菌药敏方法琼脂稀释法Etest法ATB-ANA试条报告方式报告方式无条件作生物特征鉴定的实验室：三次耐氧试验证明菌株只能在厌氧生长者 可根据培养菌的染色形态报告有条件实验室 应将细菌鉴定报告到种厌氧菌的保存厌氧菌的保存冷冻真空干燥是最好的保存方法平皿传代是较简单且实用的方法 将菌株接种布氏血琼脂平板 放入厌氧罐（或袋）中 孵箱中培养48小时 放室温阴凉处可保存两个月