天然生化物质制备大实验课件.ppt
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1、天然生化物质制备大实验天然生化物质制备大实验Experiments of Preperation of Natural Biochemical products 可再生资源利用与加工实验教学中心可再生资源利用与加工实验教学中心 主主 讲:吴石金讲:吴石金 副教授副教授1动物内脏动物内脏Cyt-c的制备及测定的制备及测定2从番茄酱中提取番茄红素和从番茄酱中提取番茄红素和-胡萝卜素胡萝卜素3虎杖中羟基蒽醌的提取、分离与鉴定虎杖中羟基蒽醌的提取、分离与鉴定4 天然天然实验二实验二Cyt-c的制备及测定的制备及测定.通过通过Cyt-c 的制备,了解蛋白质制品制的制备,了解蛋白质制品制备的一般原理和步骤
2、。备的一般原理和步骤。.掌握制备掌握制备Cyt-c的操作技术及含量测定的操作技术及含量测定方法。方法。一、目的要求一、目的要求细胞色素细胞色素c(Cyt-c)它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体,位于它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体,位于线粒体内膜外表,属于膜周蛋白,易溶于水。它与细线粒体内膜外表,属于膜周蛋白,易溶于水。它与细胞色素胞色素c1含有相同的辅基,但是蛋白组成则有所不同。含有相同的辅基,但是蛋白组成则有所不同。在电子传递过程中,在电子传递过程中,Cyt.c通过通过Fe3+Fe2+的互变起电的互变起电子传递中间体作用。子传递中间体作用。胞液侧胞液侧 基质侧基质侧 线粒体内
3、膜线粒体内膜 Q 1/2O2+2H+H2O 延胡索酸延胡索酸 琥珀酸琥珀酸 e-Cytc e-e-e-e-NADH+H+NAD+细胞色素细胞色素c(Cyt-c)Cyt-c2e-内膜内膜外外内内二、实验原理二、实验原理 Cyt-c存在于线粒体中,心肌和酵母细胞中含量丰富。存在于线粒体中,心肌和酵母细胞中含量丰富。含铁卟啉的结合蛋白质,分子量约为含铁卟啉的结合蛋白质,分子量约为13000;蛋白质部分由;蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成,赖氨酸含量较高,个左右的氨基酸残基组成,赖氨酸含量较高,pI10.7。是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于
4、水及酸性溶液,故常用酸性水提取。性水提取。分氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型呈桃分氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型呈桃红色。红色。对热较稳定,不易变性。对热较稳定,不易变性。氧化型氧化型Cyt-c在在550nm下摩尔吸收系数为下摩尔吸收系数为0.910,还原型还原型Cyt-c为为2.7710。根据已知的摩尔吸收系数,可用。根据已知的摩尔吸收系数,可用分光光度法测定分光光度法测定Cyt-c的含量的含量。摩尔吸收系数摩尔吸收系数():是指物质在:是指物质在 1mol/L 的浓度下,比色杯厚度的浓度下,比色杯厚度为为 1cm 时的吸光度。时的吸光度。:吸光度:吸光度:
5、每升溶液中物质的摩尔数:每升溶液中物质的摩尔数:比色杯内径:比色杯内径二、实验原理二、实验原理以屠宰场新鲜猪内脏为原料,经过酸溶液以屠宰场新鲜猪内脏为原料,经过酸溶液提取,人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到提取,人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到Cyt-c粗品。然后再用柱层析法将粗制品纯粗品。然后再用柱层析法将粗制品纯化,得精制品。化,得精制品。二、实验原理二、实验原理三、试剂和器材三、试剂和器材猪内脏猪内脏人造沸石,透析袋,树脂,三氯乙酸,人造沸石,透析袋,树脂,三氯乙酸,NH4OH(氨水氨水),HCl,NaCl,(NH4)2SO4,BaCl2,K3Fe(CN)6,连二亚硫酸连二亚硫酸钠,钠,Na2
6、HPO4,蒸馏水。蒸馏水。四、操作方法四、操作方法 取取50 g猪心去结缔组织绞碎放入烧杯猪心去结缔组织绞碎放入烧杯 加加50 ml 0.145 mol/L三氯乙酸三氯乙酸 4玻棒搅拌浸提玻棒搅拌浸提2 h 4层纱布过滤层纱布过滤 用用 1 mol/L NH4OH调调pH6 用用 1 mol/L NH4OH调调pH6 滤纸过滤,取滤液滤纸过滤,取滤液 用用1mol/L NH4OH调调pH7.2 按按 6g/100 ml 取沸石加入取沸石加入 搅拌搅拌1 h 待沸石变红后弃上清待沸石变红后弃上清 四、操作方法四、操作方法四、操作方法四、操作方法 待沸石变红后弃上清待沸石变红后弃上清 用用100
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