生物化学仪器分析-紫外课件.ppt

1、下午4时33分1第第3章章 紫外光谱紫外光谱Ultraviolet Spectrometry,UV主讲：孙立权主讲：孙立权2022年11月17日星期四22022年11月17日星期四33.1 紫外吸收光谱分析基本原理紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UVq3.1.1紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生q3.1.2有机物紫外吸收光谱有机物紫外吸收光谱q3.1.3有机物紫外吸收光谱有机物紫外吸收光谱q3.1.4蛋白紫外吸收光谱蛋白紫外吸收光谱q3.1.5核酸紫外吸收光谱核酸紫外吸收光谱q3.1.6紫外吸收光谱影响因素紫外吸收光谱影响因素q3.1.7 显色反应显色反应2022年11月

2、17日星期四43.1 紫外吸收光谱分析基本原理紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UVq3.1.1 3.1.1 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生Formation of UV1.1.概述概述基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。250 300 350 400nm1234e e2022年11月17日星期四52.物质对光的选择性吸收及吸收曲线物质对光的选择性吸收及吸收曲线M +热热M+荧光或磷光荧光或磷光 E=E2 -E1=h 量子化量子化；选择性吸收；选择性吸收定性依据。定性依据。M +h M*基态基态 激发态激发态E1 （E）E2202

3、2年11月17日星期四6可见可见紫外波长范围：紫外波长范围：100-800 nm.(1)远紫外光区远紫外光区:100-200nm (2)近紫外光区近紫外光区:200-400nm(3)可见光区可见光区:400-800nm3.1.1 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022年11月17日星期四7可见光谱与紫外光谱的共同之处可见光谱与紫外光谱的共同之处光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；定性依据：特征吸收；定性依据：特征吸收；定量依据：朗伯定量依据：朗伯比耳定律；比耳定律；能级跃迁：分子中价电子能级跃迁；能级跃迁：分子中价

4、电子能级跃迁；光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁动能级的跃迁带状光谱带状光谱。3.1.1 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022年11月17日星期四8可见光谱与紫外光谱的共同之处可见光谱与紫外光谱的共同之处吸收曲线（吸收曲线（A-曲线）曲线）吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。要依据。关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同3.1.1 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022年11月17日星期四9

5、p3.电子跃迁与分子吸收光谱电子跃迁与分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。）分子本身绕其重心的转动。3.1.1 紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022年11月17日星期四10p分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级转动能级p三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。p分子的

6、内能：电子能量分子的内能：电子能量Ee、振动能量、振动能量Ev、转动、转动能量能量Er即即e+v+revr 3.电子跃迁与分子吸收光谱电子跃迁与分子吸收光谱2022年11月17日星期四11p能级跃迁能级跃迁电子能级间跃迁的同电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含即电子光谱中总包含有振动能级和转动能有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干级间跃迁产生的若干谱线而呈现谱线而呈现宽谱带宽谱带。3.电子跃迁与分子吸收光谱电子跃迁与分子吸收光谱2022年11月17日星期四12讨讨 论论转动能级间的能量差转动能级间的能量差r：0.0050.

7、050eV，跃，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；转动光谱；振动能级的能量差振动能级的能量差v约为：约为：0.05eV，跃迁产，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；谱；电子能级的能量差电子能级的能量差e较大较大120eV。电子跃迁产。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光区，紫外可见光谱可见光谱或分子的电子光谱。或分子的电子光谱。2022年11月17日星期四13讨讨 论论吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能吸收光谱的波长分布是由产

8、生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。定性的依据。吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据。不同物也作为定性的依据。不同物质的质的max有时可能相同，但有时可能相同，但max不一定相同；不一定相同；吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。量分析的依

9、据。2022年11月17日星期四141 1有机化合物电子类型及电子跃迁类型有机化合物电子类型及电子跃迁类型三种价电子：三种价电子：电子、电子、电子、电子、n/p电子电子；电子跃迁类型：电子跃迁类型：n；n；。s sp p*s s*RKE,Bnp p ECOHnp ps sHq3.1.2 有机物紫外吸收光谱有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022年11月17日星期四15分子轨道理论：成键轨道分子轨道理论：成键轨道反键轨道。反键轨道。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态向

10、激发态(反键轨道反键轨道)跃迁。跃迁。主要有四种跃迁，所需能量主要有四种跃迁，所需能量大小顺序为：大小顺序为：n n 3.1.2 有机物紫外吸收光谱有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022年11月17日星期四162跃迁跃迁所需能量最大；所需能量最大；电子只有吸收远紫外光的能量电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；才能发生跃迁；饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；吸收波长吸收波长200 nm；例：甲烷的例：甲烷的max为为125nm,乙烷乙烷max为为135nm。只能被真空紫外分

11、光光度计检测到；只能被真空紫外分光光度计检测到；作为作为溶剂溶剂使用。使用。2022年11月17日星期四173n 跃迁跃迁所需能量较大。所需能量较大。吸收波长为吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。近紫外区仍不易观察到。末端吸收。末端吸收。含非键电子的饱和烃衍生物含非键电子的饱和烃衍生物(含含N、O、S和卤素和卤素等杂原子等杂原子)均呈现均呈现n跃迁。跃迁。600215CH3NH2365258CH3I200173CH3CL150184CH3OH1480167H2Oemaxmax（nm）化合物2022年11月17日星期四184 跃迁跃迁q所需能量较

12、小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，max一般在一般在104Lmol1cm1以上，属于强吸收。以上，属于强吸收。（1）不饱和烃不饱和烃*跃迁跃迁乙烯乙烯*跃迁的跃迁的max为为165nm,max为为:1104 Lmol-1cm-1。K带带共轭非封闭体系的共轭非封闭体系的*跃迁跃迁 C=C 发色基团，发色基团，但但 p p p p*200nm。ccHHHH取代基-SR-NR2-OR-Cl CH3 红移距离 45(nm)40(nm)30(nm)5(nm)5(nm)max=165nm 助色基团取代助色基团取代 p p p p*(K带带

13、)发生红发生红移移165nm 217nm p p p p p p p p p(HOMO LVMO)max （2）共轭烯烃中的）共轭烯烃中的 p p p p*2022年11月17日星期四205 n跃迁跃迁含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤对电子与碳原子上的对电子与碳原子上的*轨道，则可产生轨道，则可产生n*跃迁跃迁吸收。吸收。200 400nm。禁阻跃迁，吸收强度很弱禁阻跃迁，吸收强度很弱，200nm的光的光)，但当它们与生色团相连时，就，但当它们与生色团相连时，就会会发生发生n共轭共轭作用，增强生色团的生色能力作用，增强生色团的生色能力(吸收波

14、吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称，这样的基团称为助色团。为助色团。(auxochrome)2022年11月17日星期四247.红移与蓝移红移与蓝移红移红移:max向长波方向移动。向长波方向移动。蓝移蓝移(或紫移或紫移):max向短波方向短波方向移动。向移动。增色效应或减色效应增色效应或减色效应:吸收强吸收强度即摩尔吸光系数度即摩尔吸光系数增大或减小增大或减小的现象分别称为的现象分别称为。有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化。和吸收强度

15、发生变化。2022年11月17日星期四26吸收带及吸收带类型吸收带及吸收带类型q吸收峰对应的波长位置称为吸收带。吸收峰对应的波长位置称为吸收带。R吸收带：吸收带：由于发生由于发生n跃迁而产生的吸收带。跃迁而产生的吸收带。n为禁阻跃迁，跃迁为禁阻跃迁，跃迁几率很小；几率很小；一般地，一般地，R吸收带的吸收带的270nm，ee100；当使用极性溶剂时，当使用极性溶剂时，R吸吸收带收带发生蓝移。发生蓝移。2022年11月17日星期四27吸收带及吸收带类型吸收带及吸收带类型K吸收带：吸收带：由由*跃迁而产生的吸收带。跃迁而产生的吸收带。发生在共轭烯炔分子；发生在共轭烯炔分子；吸收很强，吸收很强，104

16、；波长位置小于波长位置小于R 吸收带。吸收带。1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非极性非极性 极性极性n p p*跃迁：跃迁：兰移；兰移；ee p p p p*跃迁：跃迁：红移；红移；ee2022年11月17日星期四28吸收带及吸收带类型吸收带及吸收带类型B吸收带：吸收带：位于位于278nm的吸收带。的吸收带。由苯环的由苯环的*跃迁引起；跃迁引起；吸收较强，吸收较强，=1100=1100；在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在极性溶剂中精细结构消失。在极性溶剂中精细结构消失。v当芳环与发色团直接相连时当芳环与发色团直接相连时会同时出现会同时出现K K、B

17、B 两带两带(B B 带波带波长较长长较长)，且，且B B 带产生红移。带产生红移。若分子中含有若分子中含有n n 电子，还会有电子，还会有R R 带同时出现。带同时出现。2022年11月17日星期四29吸收带及吸收带类型吸收带及吸收带类型E吸收带：吸收带：在一定意义上，在一定意义上，苯环可看成三个共轭的乙烯苯环可看成三个共轭的乙烯组成。组成。苯环中的这种乙烯键和共苯环中的这种乙烯键和共轭乙烯键引起的紫外吸收带轭乙烯键引起的紫外吸收带分别称为分别称为E E1 1 和和E E2 2 带。带。四种吸收带按能量高低排列：四种吸收带按能量高低排列：一般有一般有E E1 1E E2 2K KB BR R

18、2022年11月17日星期四3010.吸收波长的计算吸收波长的计算非共轭体系：非共轭体系：饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；孤立发色团。孤立发色团。共轭体系：共轭体系：共轭烯烃。共轭烯烃。165nm 217nm p p p p p p p p p(HOMO LVMO)max 基基-是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；无环、非稠环二烯母体：无环、非稠环二烯母体：max=217 nm共轭烯烃（不多于四个双键）共轭烯烃（不多于四个双键）p p p p*跃迁吸收峰位置可由跃迁吸收峰位置可由伍伍德沃德德沃德菲泽菲泽 规则估算。规则

19、估算。max=基基+ni i a.共轭烯烃中的共轭烯烃中的 p p p p*异环（稠环）二烯母体：异环（稠环）二烯母体：max=217 nm同环（非稠环或稠环）二烯母体：同环（非稠环或稠环）二烯母体：max=253 nmni I :由双键上取代基种类和个数决定的校正由双键上取代基种类和个数决定的校正项项(1)每增加一个共轭双键每增加一个共轭双键 +30(2)环外双键环外双键 +5(3)双键上取代基：双键上取代基：酰基（酰基（-OCOR）0 卤素（卤素（-Cl，-Br）+5烷基（烷基（-R）+5 烷氧基（烷氧基（-OR）+6 2022年11月17日星期四332172272022年11月17日星期

20、四342022年11月17日星期四35b.羰基化合物共轭烯烃中的羰基化合物共轭烯烃中的 p p p p*OCRY Y=H,R n s s*180-190nm p p p p*150-160nm n p p*275-295nmY=-NH2,-OH,-OR 等助色基等助色基团团K 带红移，带红移，R 带兰移；带兰移；R带带 max=205nm；ee10-100K K R R p pp pp p n p p p p n 165nm p p Ocp p p p p pp pp p p p n cOcc不饱和醛酮不饱和醛酮K带红移：带红移：165250nmR 带红移：带红移：290310nm 2022年

21、11月17日星期四36c.,-不饱和羧酸及其酯不饱和羧酸及其酯p p p p *跃迁跃迁K K 带红移程度小于带红移程度小于 ,-不饱和酮不饱和酮,maxmax约约200200 240nm240nm，ee10104 4。由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受C=CC=C上上p p电子，形成电子，形成p p p p *跃迁的能力降低，使跃迁的能力降低，使 ,-不饱和酸及酯不饱和酸及酯发生发生p p p p *跃迁需要较大的能量，跃迁需要较大的能量，maxmax蓝移。蓝移。2022年11月17日星期四37d.芳香烃及其杂环化合物芳香烃及其杂环化合物

22、 苯：苯：E E1 1带带180180 184nm184nm；e e=4700047000E2带带 2 0 0 2 0 4 n m e e=7000 苯环上三个共轭双键的苯环上三个共轭双键的 p p p p*跃迁特征吸收带；跃迁特征吸收带；B带带 2 3 0-2 7 0 n m e e=200 p p p p*与与苯环振动引起苯环振动引起；含取代基时，含取代基时，B带简化，带简化，红移。红移。max（nm）e e max苯苯254200甲苯甲苯261300间二甲苯间二甲苯2633001，3，5-三甲三甲苯苯266305六甲苯六甲苯2723002022年11月17日星期四38乙酰苯紫外光谱图乙酰

23、苯紫外光谱图羰基双键与苯环共轭：羰基双键与苯环共轭：K带强；苯的带强；苯的E2带与带与K带合带合并，红移；并，红移；取代基使取代基使B带简化；带简化；氧上的孤对电子：氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱；带，跃迁禁阻，弱；CC H3On p p*;R带带p p p p*;K带带2022年11月17日星期四39苯环上助色基团对吸收带的影响苯环上助色基团对吸收带的影响2022年11月17日星期四40苯环上发色基团对吸收带的影响苯环上发色基团对吸收带的影响.立体结构和互变结构的影响立体结构和互变结构的影响CCHHCCHH顺反异构顺反异构：顺 式：顺 式：max=2 8 0 n m；max=10500反

24、 式：反 式：m a x=2 9 5.5 n m；max=29000互变异构互变异构：酮酮 式：式：max=204 nm 烯醇式：烯醇式：max=243 nm H3CCH2CCOEtOOH3CCHCCOEtOHO2022年11月17日星期四42立体结构和互变结构的影响立体结构和互变结构的影响.溶剂的影响溶剂的影响1：乙醚乙醚2：水水12250300苯酰丙酮苯酰丙酮 非极性非极性 极性极性n p p*跃迁：跃迁：兰移；兰移；ee p p p p*跃迁：跃迁：红移；红移；ee极性溶剂使精细结构极性溶剂使精细结构消失消失.溶剂的影响溶剂的影响COCO非极性非极性 极性极性 n p p p p n p

25、 n pn p p*跃迁：跃迁：兰移；兰移；ee p p p p*跃迁：跃迁：红移；红移；ee max(正己烷正己烷)max(氯仿氯仿)max(甲醇甲醇)max(水水)pppp230238237243npp3293153093052022年11月17日星期四453.1.3 无机化合物紫外可见吸收光谱无机化合物紫外可见吸收光谱1.电荷迁移跃迁电荷迁移跃迁 (1)配合物的电荷迁移跃迁配合物的电荷迁移跃迁 配合物分子吸收光辐射后，分子中的电子由配体的配合物分子吸收光辐射后，分子中的电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上，或按相反轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上，或按相反方向转移，产生电荷迁移跃

26、迁吸收光谱。这种电方向转移，产生电荷迁移跃迁吸收光谱。这种电荷迁移光谱通常发生在具有荷迁移光谱通常发生在具有d电子的过渡金属离电子的过渡金属离子和有丌键的共轭体系的有机配位化合物及许多子和有丌键的共轭体系的有机配位化合物及许多水合无机离子中。这种配合物电荷迁移跃迁可表水合无机离子中。这种配合物电荷迁移跃迁可表达为：达为：无机配位化合物紫外无机配位化合物紫外-可见吸收光谱的电子跃迁形式可见吸收光谱的电子跃迁形式主要有电荷迁移跃迁和配位场跃迁主要有电荷迁移跃迁和配位场跃迁 两种形式。两种形式。Mn+Lb-M(n-1)+L(b-1)-h 16:33:15(2)(2)过渡金属离子与生色团试剂生成配合物

27、的电荷迁移跃迁如过渡金属离子与生色团试剂生成配合物的电荷迁移跃迁如Fe()Fe()与与CNSCNS离子配位。离子配位。Fe3+CNS-2+h Fe2+CNS2+电子给予体电子给予体电子接受体电子接受体分子内氧化还原反应分子内氧化还原反应；e e 10104 4Fe2+与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光谱属于此。谱属于此。电荷迁移吸收光谱的波长取决于电子给予体和电子接受电荷迁移吸收光谱的波长取决于电子给予体和电子接受体相应轨道的体相应轨道的能量差能量差。如金属离子的氧化性强，而配。如金属离子的氧化性强，而配位体位体L L的还原性强，则发生电荷迁移所需的能量较小，的还原性强，

28、则发生电荷迁移所需的能量较小，则吸收光波长会发生红移则吸收光波长会发生红移 电荷迁移跃迁吸收光谱的谱带较宽，并易受环境因素的电荷迁移跃迁吸收光谱的谱带较宽，并易受环境因素的影响，用其波谱定性及结构分析比较困难。但电荷迁影响，用其波谱定性及结构分析比较困难。但电荷迁移吸收光谱最大的特点是摩尔吸收系数很大，一般在移吸收光谱最大的特点是摩尔吸收系数很大，一般在10104 410107 7。因此，用这类吸收谱带进行定量分析时，可。因此，用这类吸收谱带进行定量分析时，可以显著提高检测的灵敏度。相反，则吸收光波长会发以显著提高检测的灵敏度。相反，则吸收光波长会发生紫移。生紫移。16:33:15 2 2.配

29、位场跃迁配位场跃迁（1 1）配体微扰的金属离子）配体微扰的金属离子d d-d d电子跃迁和电子跃迁和 f f-f f 电子跃迁电子跃迁 在配体的作用下过渡金属离子的在配体的作用下过渡金属离子的d d轨道和镧系、锕系的轨道和镧系、锕系的f f轨轨道裂分，吸收辐射后，产生道裂分，吸收辐射后，产生d d一一d d、f f 一一f f 跃迁；跃迁；必须在配体的配位场作用下才可能产生也称配位场跃迁；必须在配体的配位场作用下才可能产生也称配位场跃迁；（2 2）金属离子微扰的配位体内电子跃迁）金属离子微扰的配位体内电子跃迁 金属离子的微扰，将引起配位体吸收波长和强度的变化。金属离子的微扰，将引起配位体吸收波

30、长和强度的变化。变化与成键性质有关，若共价键和配位键结合，则变化非常变化与成键性质有关，若共价键和配位键结合，则变化非常明显。明显。摩尔吸收系数摩尔吸收系数 很小，对定量分析意义不大，但可用于研很小，对定量分析意义不大，但可用于研究配合物的结构，为现代无机配合物键合理论的建立、金属究配合物的结构，为现代无机配合物键合理论的建立、金属酶和生物无机化学等提供非常有用的信息。酶和生物无机化学等提供非常有用的信息。2022年11月17日星期四493.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质紫外吸收光谱u蛋白质具有很强的紫外吸收，通常情况下一般蛋白质在蛋白质具有很强的紫外吸收，通常情况下一般蛋白质在紫外区的最大

31、峰在紫外区的最大峰在280nm280nm左右左右(见图见图2 28)8)。2022年11月17日星期四503.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质紫外吸收光谱u利用蛋白质的这一特性，能够设计多种蛋白质利用蛋白质的这一特性，能够设计多种蛋白质定量分析定量分析的方法。同时，蛋白质的最大吸收峰不同于核酸的的方法。同时，蛋白质的最大吸收峰不同于核酸的260nm260nm最大吸收峰。最大吸收峰。u基于这种差异，仍然能够利用紫外吸收对含有基于这种差异，仍然能够利用紫外吸收对含有DNADNA的蛋的蛋白质样品进行定量分析。白质样品进行定量分析。u在小于在小于240nm240nm波长的紫外区有很强的光吸收效应，但较

32、波长的紫外区有很强的光吸收效应，但较难利用这一特性。难利用这一特性。这是因为，在这一紫外区，很多缓冲液具有很强的紫外吸这是因为，在这一紫外区，很多缓冲液具有很强的紫外吸收，并且缓冲液一般浓度很高，这会严重干扰蛋白质的定量分析。但如果背景缓冲液收，并且缓冲液一般浓度很高，这会严重干扰蛋白质的定量分析。但如果背景缓冲液不具有紫外吸收的特性，则可以充分利用蛋白质在不具有紫外吸收的特性，则可以充分利用蛋白质在200200220nm220nm的强紫外吸收性质的强紫外吸收性质。2022年11月17日星期四513.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收特性主要是由蛋白质所含的蛋白质的紫

33、外吸收特性主要是由蛋白质所含的酪氨酸、色酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸氨酸和苯丙氨酸等引起。等引起。u由于苯环由于苯环(包括共轭双键等包括共轭双键等)的存在，这几种氨基酸在的存在，这几种氨基酸在240240300nm300nm的紫外区内均具有强力的光吸收特性；虽然其的紫外区内均具有强力的光吸收特性；虽然其他氨基酸也具有紫外吸收的性质，但在此紫外区内一般很他氨基酸也具有紫外吸收的性质，但在此紫外区内一般很弱，对蛋白质的紫外吸收贡献不大。弱，对蛋白质的紫外吸收贡献不大。2022年11月17日星期四523.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收受多种因素的影响。蛋白质的紫外吸收受多种

34、因素的影响。u由于蛋白质分子为高分子聚合物，其构象受多种由于蛋白质分子为高分子聚合物，其构象受多种 因素因素(如溶液的如溶液的pHpH、离子强度、金属离子、温度和变性剂等、离子强度、金属离子、温度和变性剂等)的的影响；而蛋白质构象的变影响；而蛋白质构象的变 化会改变具有紫外吸收的氨基酸化会改变具有紫外吸收的氨基酸在蛋白质表面的分布，进而影响蛋白质的紫外吸收光谱。在蛋白质表面的分布，进而影响蛋白质的紫外吸收光谱。特别值得注意的是，如蛋白质富含紫外吸收的氨基酸，其特别值得注意的是，如蛋白质富含紫外吸收的氨基酸，其吸收系数会增加；相反，则降低。这吸收系数会增加；相反，则降低。这 在蛋白质的定量分析在

35、蛋白质的定量分析时需要注意。时需要注意。2022年11月17日星期四533.1.5 核酸紫外吸收光谱核酸紫外吸收光谱u核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶碱基，这些核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶碱基，这些碱基全含有共轭双键，使得这些碱基能强烈吸收碱基全含有共轭双键，使得这些碱基能强烈吸收240240290nm290nm波段的紫外线，最大吸收在波段的紫外线，最大吸收在260nm260nm左右。左右。u因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，DNADNA钠盐钠盐在在230nm230nm处为吸收低谷，但它的紫外吸收在处为吸收低谷，但它的紫外吸收在26

36、0nm260nm附近有附近有最大吸收值，其吸光度最大吸收值，其吸光度(absorbance)(absorbance)以以A260A260表示，表示，A260A260是核是核酸的重要性质酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。，在核酸的研究中很有用处。RNARNA钠盐的吸钠盐的吸收曲线与收曲线与DNADNA的无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特的无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。性，所以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。2022年11月17日星期四543.1.5 核酸紫外吸收光谱核酸紫外吸收光谱u双链双链DNADNA和单链和单链DNADNA的紫外光谱

37、相似，摩尔吸收系数的紫外光谱相似，摩尔吸收系数有大差。原因：双链中碱基被包裹在双链内部，弱；单链有大差。原因：双链中碱基被包裹在双链内部，弱；单链外露，强。外露，强。u 温度对温度对DNADNA的紫外吸收有明显的影响。在温度为的紫外吸收有明显的影响。在温度为7070C C以以下，下，DNADNA以双链形式存在，因此紫外吸收相对较低。以双链形式存在，因此紫外吸收相对较低。u在在70708585C C时，温度对时，温度对DNADNA的紫外吸收具有显著的影响。的紫外吸收具有显著的影响。u8585C C以后，温度的增加对以后，温度的增加对DNADNA紫外吸收的影响很弱，这是紫外吸收的影响很弱，这是由于

38、在由于在8585C C以上，以上，DNADNA以单链形式存在，紫外吸收接近最大以单链形式存在，紫外吸收接近最大值。值。u变性温度变性温度(melting temperature(melting temperature，Tm)Tm)是指双链是指双链DNADNA分离成两分离成两个单链个单链DNADNA时对应的温度。这一特性对时对应的温度。这一特性对DNADNA的分离分析非常的分离分析非常重要。如重要。如PCRPCR的设计就是基于的设计就是基于DNADNA的变性温度的基础。的变性温度的基础。3.1.6 影响影响UVUVVisVis分析的因素分析的因素：【1 1】温度温度 【3 3】溶液的浓度溶液的浓

39、度【2 2】pHpH的影响的影响【4 4】光源狭缝的宽度光源狭缝的宽度【5 5】背景的吸收背景的吸收 1 1】条件条件 化学反应，也就是显色反应化学反应，也就是显色反应对多种物质进行测定，常利用显色反应将对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。还原反应等。3.1.7 这些显色反应，必须满足以下条件：这些显色反应，必须满足以下条件：【4 4】.反应生成物的组成恒定。反应生成物的组成恒定。【3 3】.反应生成的产物有足够的稳定性，反应生成的产物有足

40、够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；以保证测量过程中溶液的吸光度不变；【2 2】反应有较高的选择性，即被测组分反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；收光谱有明显的差别；【1 1】反应的生成物必须在紫外反应的生成物必须在紫外-可见光区可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；影响显色反应的因素：影响显色反应的因素：【1 1】酸度酸度 显色反应最适宜的酸度范围可通过实显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸验来确定：测定某一固定浓度的试

41、样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的溶液的PHPH值为横坐标作图。值为横坐标作图。【3 3】.显色时间和温度显色时间和温度【2 2】.显色剂的用量显色剂的用量 测定试样溶液的吸光度，需先用参比测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为溶液调节透光度（吸光度为0 0）为）为100%100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。反射和吸收带来的测定误差。参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：1 1】溶剂参比溶剂参比 试样简单、共存其它成试

42、样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；吸收池等因素；2 2】试样参比试样参比 如果试样基体溶液在如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。处理试样，只是不加入显色剂。3 3】试剂参比试剂参比 如果显色剂或其它试剂如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。剂作为参比

43、溶液。4 4】.平行操作参比平行操作参比 用不含被测组分的用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。进行处理，由此得到平行操作参比溶液。2022年11月17日星期四633.2 紫外分光光度计紫外分光光度计Ultraviolet spectrometern一、基本组成一、基本组成general processn二、分光光度计的类型二、分光光度计的类型types of spectrometer2022年11月17日星期四64一、基本组成一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1.光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射

44、连续光谱，具有在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：可见光区：钨灯作为钨灯作为光源，其辐射波长范围光源，其辐射波长范围在在3202500 nm。紫外区：紫外区：氢、氘灯。氢、氘灯。发射发射185400 nm的的连续光谱。连续光谱。2022年11月17日星期四652、单色器、单色器n将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。出任一波长单色光的光学系统。n棱镜材料棱镜材料石英石英2022年11月17日星期四663、样品室、

45、样品室n样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。池架附件。n吸收池主要有吸收池主要有石英池石英池和玻璃池两种。和玻璃池两种。n在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。2022年11月17日星期四674、检测器、检测器n利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号测的电信号n常用的有光电池、光电管或光电倍增管。常用的有光电池、光电管或光电倍增管。2022年11月17日星期四685、结果显示记录系统、结果显示记录系统n检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制

46、和检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。结果处理。2022年11月17日星期四69二、紫外分光光度计的类型二、紫外分光光度计的类型n1.单光束：简单，价廉，适于在给定波单光束：简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。有很高的稳定性。n2.双光束：自动记录，快速全波段扫描。双光束：自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，

47、价格较高。仪器复杂，价格较高。2022年11月17日星期四70二、分光光度计的类型二、分光光度计的类型n3.双波长：将不同双波长：将不同波长的两束单色光波长的两束单色光(1、2)快速交替快速交替通过同一吸收池而通过同一吸收池而后到达检测器。产后到达检测器。产生交流信号。生交流信号。n无需参比池。无需参比池。=12nm。两。两波长同时扫描即可波长同时扫描即可获得导数光谱。获得导数光谱。2022年11月17日星期四71光路图2022年11月17日星期四723.3 紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用Applications of UV一、定性和定量分析一、定性和定量分析qualitative an

48、d quantitative analysis二、有机物结构确定二、有机物结构确定structure determination of organic compounds2022年11月17日星期四73一、定性、定量分析一、定性、定量分析1.定性分析定性分析 e emax：化合物特性参数，可作为定性依据；：化合物特性参数，可作为定性依据；有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性；特性，不完全反映分子特性；计算吸收峰波长，确定共轭体系等计算吸收峰波长，确定共轭体系等 甲苯与乙苯：谱图基本相同；甲苯与乙苯：谱图基本

49、相同；结构确定的辅助工具；结构确定的辅助工具；e emax，max都相同，可能是一个化合物；都相同，可能是一个化合物；标准谱图库：标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图种化合物紫外光谱的标准谱图 The sadtler standard spectra,Ultraviolet 2022年11月17日星期四742.纯度鉴定纯度鉴定依据：依据：max；峰形状和数量；峰形状和数量；A。生物大分子紫外吸收特征。生物大分子紫外吸收特征。核酸分子中含有碱基，核酸分子中含有碱基，max=260nm核酸典型吸收：核酸典型吸收：260nm；纯核酸；纯核酸A280/A260=0.5。蛋白质分子中含有芳香

50、族氨基酸，蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，max=280nm蛋白质典型吸收：蛋白质典型吸收：280nm；纯蛋白；纯蛋白A280/A260 1.8。2022年11月17日星期四753.定量分析定量分析依据：朗伯依据：朗伯-比耳定律比耳定律吸光度：吸光度：A=e e b c；透光度：透光度：-lgT=e e b c。灵敏度高：灵敏度高：e emax：104105 L mol-1 cm-1；测量误差与吸光度读数有关：测量误差与吸光度读数有关：A=0.434，读数相对误差最小；，读数相对误差最小；代入朗伯代入朗伯-比尔定律有：比尔定律有：c/cc/c=0.4343T/TlgT=0.4343T/TlgT要