代谢控制育种教学课件.ppt

1、第四节 代谢调节控制育种 代谢调节控制育种是通过特定突变型的选代谢调节控制育种是通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。外因控制外因控制培养调节培养调节内因控制内因控制突变体突变体1调节体系调节体系育种措施育种措施诱导诱导分解阻遏分解阻遏分解抑制分解抑制1组成型突变株的选育组成型突变株的选育2抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育 解除碳、氮、磷源分解调节突变株解除碳、氮、磷源分解

2、调节突变株反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制营养缺陷突变株营养缺陷突变株渗漏缺陷突变株渗漏缺陷突变株回复突变株回复突变株耐自身代谢产物突变株耐自身代谢产物突变株抗终产物结构类似物抗终产物结构类似物耐前体物突变株耐前体物突变株条件突变株条件突变株细胞膜渗透性细胞膜渗透性营养缺陷突变株营养缺陷突变株生物素、油酸、甘油缺陷型生物素、油酸、甘油缺陷型温敏突变株温敏突变株2一、组成型突变株的选育 组成型突变株是指操纵基因或调节基因组成型突变株是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调

3、节突变型。节突变型。这两种突变株在工业上都可能得到应用，这两种突变株在工业上都可能得到应用，特别是在微生物酶制剂工业上。特别是在微生物酶制剂工业上。Regulatory generepressorNOoperatorrepressorNOoperator3筛选方法1、限量诱导物法、限量诱导物法 诱变诱变恒化器恒化器 低乳糖浓低乳糖浓度度 突变株不需诱导物也能合成突变株不需诱导物也能合成-半乳糖半乳糖苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能源和代谢原料，而迅速生长。能源和代谢原料，而迅速生长。野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导酶

4、，不能利用乳糖而淘汰。酶，不能利用乳糖而淘汰。42、循环培养法、循环培养法 诱变诱变 不含诱不含诱导物导物 不含诱不含诱导物导物 含诱导物含诱导物 含诱导物含诱导物 53、鉴别性培养基的应用、鉴别性培养基的应用诱变后的诱变后的孢子孢子 以甘油为唯一碳源以甘油为唯一碳源 涂布涂布 向菌落上喷射向菌落上喷射O-硝基苯酚硝基苯酚-D-半乳糖苷半乳糖苷组成型组成型突变株突变株诱导型诱导型原理原理：组成型菌株在没有诱导物的作用下组成型菌株在没有诱导物的作用下仍能合成仍能合成 半乳糖苷酶半乳糖苷酶，将无色试剂水解，将无色试剂水解，放出放出 O硝基苯酚。硝基苯酚。64、筛选 将处理后的菌体移接到含有诱导能力

5、将处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。不能生长。例：例：-半乳糖苷酶组成突变株的筛选半乳糖苷酶组成突变株的筛选 底物采用苯底物采用苯-半乳糖半乳糖7二、抗分解调节突变株的选育 抗分解调节突变株：指抗抗分解调节突变株：指抗分解阻遏分解阻遏和和分解抑分解抑制制的突变的突变（一）解除（一）解除碳碳源调节突变株的选育源调节突变株的选育（二）解除（二）解除氮氮源分解调节突变株的选育源分解调节突变株的选育（三）解除（三）解除磷磷酸盐调节突变株的选育酸盐调节突变株的选育

6、 选育有关抗分解调节的突变株，其实就选育有关抗分解调节的突变株，其实就是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生使抗生素提前到菌体生长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。量。8（一）解除碳源调节突变株的选育n 在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。n 在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不利影响。n 根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变株。9筛选方法：筛

7、选方法：1、循环培养法、循环培养法 2、鉴别培养基、鉴别培养基 喷喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野生生 型是白色。型是白色。3、特殊氮源、特殊氮源组氨酸酶突变株组氨酸酶突变株 葡萄糖葡萄糖+组氨酸组氨酸 分解代谢抑制物分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源唯一必须被分解的氮源 O-硝基苯硝基苯酚酚-D-半半乳糖苷乳糖苷（一）解除碳源调节突变株的选育葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖突变株突变株 野生株野生株有半乳糖酶有半乳糖酶10n4、葡萄糖结构类似物、葡萄糖结构类似物CH2OHCHO OHOHOHHHHHHOCH2OHCHO HOHOHHHHHHOCHO OHOOHOHH

8、HHHH3C-OCH2OH葡萄糖葡萄糖2-脱氧葡萄糖脱氧葡萄糖3O甲基甲基葡萄糖葡萄糖11特特 性：性：1、结构与葡萄糖类似。、结构与葡萄糖类似。2、不被微生物代谢，、不被微生物代谢，也不阻抑微也不阻抑微生物生长。生物生长。3、和葡萄糖、和葡萄糖 一样一样 会阻遏诱导酶的会阻遏诱导酶的合成，其合成，其 阻遏作用阻遏作用 甚至比葡萄糖还甚至比葡萄糖还要强。要强。12n筛选方法：筛选方法：不不含含阻阻遏遏物物涂布涂布 诱变诱变后的后的菌株菌株培养基含有氮源、无机盐、生培养基含有氮源、无机盐、生长因子、低浓度的长因子、低浓度的2dG或或3mG及及一种生长碳源一种生长碳源，该碳源，该碳源需诱导酶才能利

9、用需诱导酶才能利用验证验证含阻遏物含阻遏物比比较较13n例如：例如：桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨及含有酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。的琼脂平板。n木霉合成木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素纤维素酶：含酸膨胀纤维素、蛋白、蛋白胨、无机盐、胆汁胨、无机盐、胆汁、防菌扩展剂、防菌扩展剂、2-dG的琼的琼脂平板。脂平板。14抗性突变株的性质n在在2-dG或或3-mG平板上生长的菌落接入斜面，平板上生长的菌落接入斜面，对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分

10、解酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养基中酶活力往往高于野生型菌株。基中酶活力往往高于野生型菌株。含葡萄糖含葡萄糖 不含不含葡萄糖葡萄糖含淀粉含淀粉15（二）解除氮源分解调节突变株的选育n次级代谢的氮降解物的阻遏主要指次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他铵盐和其他快速利用快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。节作用。n筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑产量的一种有效方法。因为高浓度

11、氨基酸会抑制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。氨基酸氨基酸1.5mg/ml水解蛋白水解蛋白10mg/ml16（三）磷酸盐对次级代谢的调节 机制1.通过初级代谢的变化影响次级代谢通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始。始。磷酸盐是许多初级代谢反应酶的磷酸盐是许多初级代谢反应酶的效应物。效应物。2.改变糖类分解代谢途径：改变糖类分解代谢途径：磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制。的抗生素合成

12、受抑制。例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃霉素霉素173.限制抗生素合成的诱导物限制抗生素合成的诱导物 甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物 色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸合成酶等的抑制剂；合成酶等的抑制剂；4.抑制或阻遏抑制或阻遏磷酸酯酶类磷酸酯酶类的合成的合成 链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些中间代谢产物需经中间代谢产物需经磷酸化磷酸化，因此从中间产物到，因此从中间产物到终产物需由磷酸酯酶类，终产物需由磷酸酯酶类，而磷酸盐抑制或阻遏

13、而磷酸盐抑制或阻遏磷酸酯酶的合成。磷酸酯酶的合成。例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑制形成链霉胍的三步制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。磷酸盐分解反应。18n磷酸盐对磷酸盐对ATP调节：调节：cAMP ATPn例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐对杀假丝菌素合成的影响。当加入对杀假丝菌素合成的影响。当加入10mol/L磷酸盐后，磷酸盐后，5minATP增加增加5倍，倍，15min抗生素合成受抑制。抗生素合成受抑制。n发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。19解除（抗）磷酸盐调节突变株的

14、选育底部加浸润底部加浸润250mm/L磷酸盐的滤纸磷酸盐的滤纸灰色链霉菌灰色链霉菌诱变后涂布于琼脂平诱变后涂布于琼脂平板板含含10mol/LNa3PO4不含不含Na3PO4脱敏感脱敏感突变突变敏感菌20三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用n生物遗传学上：阐述代谢途径生物遗传学上：阐述代谢途径n工业微生物代谢控制育种上：筛选工业微生物代谢控制育种上：筛选到解除反馈的菌株。到解除反馈的菌株。21（一）在初级代谢调节育种的应用1.阻断阻断代谢流或切断支路代谢，使代谢途代谢流或切断支路代谢，使代谢途径朝着有益产物合成方向进行。径朝着有益产物合成方向进行。2.还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效还可以通过

15、营养缺陷型解除协同反馈效应，降低终产物的数量，以应，降低终产物的数量，以累积支路代累积支路代谢谢中某一末端产物。中某一末端产物。221、在直线式生物合成途径中谷氨酸谷氨酸N-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸N-乙酰乙酰-谷氨酸磷酸谷氨酸磷酸N-乙酰谷氨酸半醛乙酰谷氨酸半醛N-乙酰鸟氨酸乙酰鸟氨酸鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酰琥珀酸精氨酰琥珀酸精氨酸精氨酸利用氨基酸缺陷型利用氨基酸缺陷型突变株进行鸟氨酸突变株进行鸟氨酸发酵发酵232、在分支生物合成途径中葡萄糖葡萄糖乙酰辅酶乙酰辅酶A柠檬酸柠檬酸酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸硫胺素硫胺素生物素生物素脂肪酸脂肪酸谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产生谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产

16、生L谷氨酸的生物谷氨酸的生物合成途径合成途径245-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖焦磷酸次黄嘌呤核苷酸次黄嘌呤核苷酸琥珀酸腺核苷酸琥珀酸腺核苷酸腺核苷酸腺核苷酸黄嘌呤核苷酸黄嘌呤核苷酸鸟核苷酸鸟核苷酸酶缺失酶缺失例：例：谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成代谢途径代谢途径协同反馈25天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺赖氨酸赖氨酸 高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径途径高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶脱氢酶协同反馈抑制DES同工酶26（二）在次级代谢育种中的应用丙二酰丙二酰CoA灰黄霉素灰黄

17、霉素 四环素四环素制霉菌素制霉菌素脂肪酸脂肪酸 抗生素产量受脂肪酸代谢途径抗生素产量受脂肪酸代谢途径的影响的影响脂肪酸缺陷型27n氯霉素产生菌初级代谢途径中的氯霉素产生菌初级代谢途径中的色氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸中的任何一个氨基酸中的任何一个氨基酸发生营养缺陷突变，都会使氯霉素产量发生营养缺陷突变，都会使氯霉素产量增加。增加。n营养缺陷菌株还可以产生新品种。营养缺陷菌株还可以产生新品种。金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供应，金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供应，若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生去甲基若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生去甲基金霉素。金霉素。四环素合成中，甲基化酶缺失，便形四环

18、素合成中，甲基化酶缺失，便形成了去甲基四环素。成了去甲基四环素。28例例2赤藓糖赤藓糖4 4磷酸磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸莽草酸预苯酸预苯酸L L-苏对氨基苏对氨基苯丝氨酸苯丝氨酸DAPHDAPH分支分支酸酸L-L-对氨基对氨基苯丙氨酸苯丙氨酸氯霉素氯霉素酪氨酸酪氨酸邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸酸色氨酸色氨酸PABAPABA杀假丝杀假丝菌素菌素苯丙氨酸苯丙氨酸其它例子见p23529四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的应用应用n渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型n特点：酶活力下降，但不完全丧失，能在基特点：酶活力下降，

19、但不完全丧失，能在基本培养基上少量生长。本培养基上少量生长。n筛选方法：筛选方法：营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株 基本培养基基本培养基30天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺赖氨酸赖氨酸 高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径途径高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶脱氢酶协同反馈抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶活脱氢酶活力下降，力下降，没有完全没有完全丧失丧失31五、抗反馈调节突变株的选育 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，

20、不会因其其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。浓度超量而终止生产。n “抗反馈抑制突变型抗反馈抑制突变型”n “抗阻遏突变型抗阻遏突变型”Structure geneproductEnzyme调节中心调节中心NORegulatory geneproteinproductNOoperator32在实际应用中，解除反抗调节可由以下方面：1.从遗传上解除反馈调节从遗传上解除反馈调节 各各种抗性和耐性育种，回复突变子的应用种抗性和耐性育种，回复突变子的应用2.截流或减少终产物堆积截流或减少终产物堆积 借借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型3.移去产物移去产物 借借

21、助膜透性突变助膜透性突变33抗反馈调节突变株获得途径（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株（二）耐自身产物突变株选育（二）耐自身产物突变株选育（三）抗终产物结构类似物突变株的选育（三）抗终产物结构类似物突变株的选育（四）累积前体和耐前体突变株的选育（四）累积前体和耐前体突变株的选育34（一）回复突变引起抗反馈调节突变株正向突变：正向突变：微生物从野生型经自然突变或人工诱微生物从野生型经自然突变或人工诱变突变成有益突变型。变突变成有益突变型。回复突变：回复突变：当具有突变型基因的个体通过再突变当具有突变型基因的个体通过再突变又变成野生型表型。又变成野生型表型。噬

22、菌体敏感噬菌体敏感野生型野生型噬菌体抗性噬菌体抗性突变株突变株噬菌体敏感噬菌体敏感野生型表型野生型表型 前后表型同，但实质有区别351、回复突变的原因（1）原有基因的回复突变）原有基因的回复突变（2）非原有基因的回复突变）非原有基因的回复突变原有基因位点原有基因位点 消除消除A基因基因C基因基因B基因基因ACBACB原有基因不同原有基因不同位点位点不同基因不同不同基因不同位点位点基因内抑制突变基因内抑制突变真正回复突变真正回复突变抑制基因突变抑制基因突变36n 区别基因回复突变和抑制基因突变，可以区别基因回复突变和抑制基因突变，可以将回复突变菌株和野生菌株进行将回复突变菌株和野生菌株进行回交回

23、交试验或试验或杂交杂交重组试验来观察它们的子代是否有突变重组试验来观察它们的子代是否有突变型出现：型出现：n 杂交结果有同样的杂交结果有同样的突变型重新出现突变型重新出现，说明，说明回复突变和原来突变型不在同一座位上而是回复突变和原来突变型不在同一座位上而是分开的，属于抑制回复突变。反之，如果分开的，属于抑制回复突变。反之，如果杂杂交后代没有产生突变型交后代没有产生突变型，表明回复突变的座，表明回复突变的座位与原突变型基因位点相同，是真正的回复位与原突变型基因位点相同，是真正的回复突变。突变。37回复突变的测定n回复突变常发生在遗传物质没有明显获得或缺失的点突变。苏氨酸营养缺陷型基本培养基38

24、抗链霉素细菌的回复突变n依赖性突变株：抗链霉素突变株中有少数必须在有链霉素存在的时候才能生长。诱变后的菌株含链霉素含链霉素不含链霉素含链霉素不含链霉素依赖性突变株392、回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选（1）初级代谢途径障碍性回复突变型）初级代谢途径障碍性回复突变型原养型原养型营缺型营缺型原养型原养型诱变诱变诱变诱变酶活力恢复，但调节中心已发生改变，酶活力恢复，但调节中心已发生改变，不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制405-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖焦磷酸次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷酸酸琥珀酸腺核苷琥珀酸腺核苷酸酸腺核苷酸腺核苷酸酶活力恢复，酶活力恢复

25、，调节中心改变调节中心改变鸟核苷酸鸟核苷酸酶缺失酶缺失例：例：黄嘌呤核苷酸黄嘌呤核苷酸41（2）次级代谢途径障碍性回复突变）次级代谢途径障碍性回复突变n抗生素回复突变株抗生素回复突变株n零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但回复突变株的产量往往比亲株高。回复突变株的产量往往比亲株高。原养型原养型营缺型营缺型原养型原养型诱变诱变诱变诱变原养型原养型零变株零变株原养型原养型诱变诱变诱变诱变例如金霉素、链霉素42 一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突变株往陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突

26、变株往往比原养型亲株高。往比原养型亲株高。营养缺陷型菌株中，几种不能合成的营养缺陷型菌株中，几种不能合成的氨基酸与抗生素合成有关。基因突变的结氨基酸与抗生素合成有关。基因突变的结果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种酶的活力，导致抗生素产量酶的活力，导致抗生素产量 下降。下降。而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节中心变化，氨基酸能大量合成。中心变化，氨基酸能大量合成。抗生素大量合成。抗生素大量合成。氨基酸抗生素43甲硫氨酸金霉素亮氨酸缬氨酸放线菌素44（二）耐自身产物突变株选育自身产物：初级代谢产物自身产物：初级代谢产物 次级代

27、谢产物次级代谢产物n大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别是氨基糖苷类抗生素。是氨基糖苷类抗生素。n提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。n选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌株。株。n筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐级提高抗生素的浓度。级提高抗生素的浓度。45从土壤中筛选Aurdox20-40mg/L改良培养基和培养条件500mg/L紫外线诱变，零突变0mg/L紫外线诱变，回复突变600mg/L耐自身抗生素1.6-2.5g/L46 除耐受自身产物之外

28、，还可以考虑与以下除耐受自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：情况结合进行：1、抗、抗Mg2+离子突变，根据以氨基糖苷类抗生离子突变，根据以氨基糖苷类抗生素为材料的研究，素为材料的研究，Mg2+可提高产生菌的耐可提高产生菌的耐受性，以此设想筛选抗高浓度受性，以此设想筛选抗高浓度Mg2+的突变的突变株，如卡那霉素、新霉素、链霉素等培养基株，如卡那霉素、新霉素、链霉素等培养基中加入中加入520mmol/L Mg2+能显著提高产生能显著提高产生菌自身耐受性。菌自身耐受性。2、设想筛选高活性钝化酶的变株，其自身耐、设想筛选高活性钝化酶的变株，其自身耐受性也会提高。受性也会提高。47（三）抗终产物

29、结构类似物突变株的 选育 抗代谢结构类似物育种是最早采用并取抗代谢结构类似物育种是最早采用并取得显著成效的代谢育种方法。从得显著成效的代谢育种方法。从50年代以年代以来在发酵工业上提高氨基酸、核苷酸、维生来在发酵工业上提高氨基酸、核苷酸、维生素产量已取得相当成效，成为当今初级代谢素产量已取得相当成效，成为当今初级代谢产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。481、结构类似物及性质I.结构类似物：那些在结构上和代谢终产物（氨基结构类似物：那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质酸、嘌呤、维生素等）相似的物质II.性质：性质：和变构酶的调节中心结

30、合引起阻抑反馈。和变构酶的调节中心结合引起阻抑反馈。假反馈抑制：终产物与酶结合是可逆的。类似物假反馈抑制：终产物与酶结合是可逆的。类似物不会掺入细胞结构，酶活性不会恢复。不会掺入细胞结构，酶活性不会恢复。不像氨基酸那样掺入细胞结构，在细胞中的浓度不像氨基酸那样掺入细胞结构，在细胞中的浓度不变。对微生物具有致死或抑菌作用。不变。对微生物具有致死或抑菌作用。含结构类似物的培养基上，野生型菌株不能生长，含结构类似物的培养基上，野生型菌株不能生长，抗结构类似物突变株能生长。抗结构类似物突变株能生长。解除机制对结构类似物或对终产物都是有效的解除机制对结构类似物或对终产物都是有效的49精氨酸刀豆氨酸异亮氨

31、酸缬氨酸2噻唑丙氨酸苏氨酸氨基羟基戊酸D精氨酸甲硫氨酸乙硫氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸 组氨酸2噻唑丙氨酸酪氨酸对氟病丙氨酸 瓜氨酸磺胺胍D酪氨酸尿嘧啶5氨尿嘧啶3氨基酪氨酸腺嘌呤26氨基嘌呤503、结构类似物抗性突变株的获得51抗性突变株的检出A增殖圈增殖圈结构类似物结构类似物突变株合突变株合成氨基酸成氨基酸涂工涂工具菌具菌突变株能够生长，野生型不生长52n抗代谢类似物的筛选方法，一般抗代谢类似物的筛选方法，一般采用浓度梯度法：采用浓度梯度法：上层加入含异烟肼上层加入含异烟肼培养基培养基下层不加含异烟肼下层不加含异烟肼培养基培养基浓度逐渐降低浓度逐渐降低高抗性菌落高抗性菌落敏感菌落敏感菌落酵母生

32、产吡多醇532、较之营养缺陷型有如下优点（1）如果能找到适当的结构类似物，用此种育种方）如果能找到适当的结构类似物，用此种育种方法法简单易行且效果显著简单易行且效果显著；（2）采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是）采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是通通过控制培养基中所需的营养物质浓度过控制培养基中所需的营养物质浓度来实现的，来实现的，并没有从遗传上根本解除代谢调节。由于所需求并没有从遗传上根本解除代谢调节。由于所需求的营养物质的量不易控制，往往使代谢产物不稳的营养物质的量不易控制，往往使代谢产物不稳定，而抗结构类似物突变株的定，而抗结构类似物突变株的代谢调节被解除，代谢调节被解除，生产操

33、作方便，产量稳定；生产操作方便，产量稳定；（3）抗结构类似物突变株）抗结构类似物突变株易于保存，而且不发生回易于保存，而且不发生回复突变，复突变，只要在保存培养基中加适量结构类似物，只要在保存培养基中加适量结构类似物，即可防止回复突变。即可防止回复突变。54谷氨酸谷氨酸N-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸N-乙酰乙酰-谷氨酸磷酸谷氨酸磷酸N-乙酰谷氨酸半醛乙酰谷氨酸半醛N-乙酰鸟氨酸乙酰鸟氨酸鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酰琥珀酸精氨酰琥珀酸精氨酸精氨酸直线合成途径直线合成途径结构类似物：结构类似物：刀豆氨酸刀豆氨酸2-噻唑丙氨酸噻唑丙氨酸D-精氨酸精氨酸19.6mg/mL55苏氨酸苏氨酸分支合成途径分支合

34、成途径天冬酰胺天冬酰胺丙酮酸丙酮酸 异亮氨酸异亮氨酸 天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛高丝氨酸高丝氨酸赖氨酸赖氨酸 天冬氨酸磷酸天冬氨酸磷酸蛋氨酸蛋氨酸结果：结果：HD活性提活性提高高1300倍产量达倍产量达14g/L虽有调节机制，虽有调节机制，但但Thr优先合成，优先合成，Lys 处于低浓度。处于低浓度。2氨基乙基L半胱氨酸乙硫氨酸2氨基3羟基戊酸56举例L-赖氨酸合成步骤赖氨酸合成步骤天冬氨天冬氨酸激酶酸激酶2，3-二氢二二氢二羧酸合成酶羧酸合成酶57从上图可以看出，影响从上图可以看出，影响L-赖氨酸产量的因素表现赖氨酸产量的因素表现在在3个方面：个方面：一、一、L-赖氨酸和赖氨酸

35、和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶二、二、L-亮氨酸会抑制亮氨酸会抑制2，3-二氢二羧酸合成酶二氢二羧酸合成酶三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而丙酮三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而丙酮酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的共同前酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的共同前体，因此丙氨酸等生成可减少赖氨酸的合成。体，因此丙氨酸等生成可减少赖氨酸的合成。58育种过程：育种过程：（1）在含有）在含有SAEC（硫代赖氨酸，为赖氨（硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物）的培养基上筛选出酸的结构类似物）的培养基上筛选出SAEC抗性的突变株，使菌株的天冬氨酸抗性的突变株，使菌株的天冬氨

36、酸激酶对激酶对L-赖氨酸和赖氨酸和L-苏氨酸不敏感。为了苏氨酸不敏感。为了进一步的提高产量，接下来还有多种选择：进一步的提高产量，接下来还有多种选择：59其一、在其一、在SAEC抗性调节突变菌株基础上进一步抗性调节突变菌株基础上进一步筛选筛选L-亮氨酸缺陷型突变株，解除亮氨酸缺陷型突变株，解除L-亮氨酸的亮氨酸的2，3-二氢二羧酸合成酶的抑制。二氢二羧酸合成酶的抑制。其二、在其二、在SAEC抗性突变菌株基础上再进一步筛抗性突变菌株基础上再进一步筛选出选出L-丙氨酸营养缺陷型菌株。丙氨酸营养缺陷型菌株。其三，在其三，在SAEC抗性突变菌株基础上，选育对抗性突变菌株基础上，选育对SAEC、-甲基甲

37、基-L-L-丙氨酸（丙氨酸（L-L-丙氨酸类似物）丙氨酸类似物）和和-氯代己内酰氨（氯代己内酰氨（L-L-亮氨酸的结构类似物）亮氨酸的结构类似物）具有多重抗性的具有多重抗性的L-L-丙氨酸营养缺陷型菌株，则丙氨酸营养缺陷型菌株，则L-L-赖氨酸产量会提高更多赖氨酸产量会提高更多60通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：615-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖焦磷酸次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷酸酸琥珀酸腺核苷琥珀酸腺核苷酸酸腺核苷酸腺核苷酸鸟核苷酸鸟核苷酸酶缺失酶缺失例：例：黄嘌呤核苷酸黄嘌呤核苷酸8氮鸟嘌呤62举例：举例：S-腺苷腺苷-L-蛋氨酸（蛋氨酸（SAM）SAM：是

38、甲硫氨酸：是甲硫氨酸(Met)的活性形式。的活性形式。在动植物体内广泛存在动植物体内广泛存在，它是由底物在，它是由底物L-甲甲硫氨酸和硫氨酸和ATP经经S-腺腺苷甲硫氨酸合成酶酶苷甲硫氨酸合成酶酶促合成的。促合成的。63细胞内存在两种细胞内存在两种S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶腺苷甲硫氨酸合成酶酶SAM1：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在下受到抑制下受到抑制SAM2：转录不受蛋氨酸的抑制：转录不受蛋氨酸的抑制据此，可大大提高据此，可大大提高SAM2在在DNA的拷贝的拷贝64（四）累积前体和耐前体突变株的选育1、前体对抗生素生物合成的影响：、前体对抗生素生物合成的影响：（

39、1）作为组成成分掺入生物合成）作为组成成分掺入生物合成（2）导致反馈调节）导致反馈调节（3）引起毒性）引起毒性解决办法：筛选耐前体的突变株解决办法：筛选耐前体的突变株652、筛选方法（1）耐）耐“毒性毒性”前体突变株的选育前体突变株的选育（2）耐前体结构类似物突变株的选育）耐前体结构类似物突变株的选育（3）耐前体的有关代谢物突变株选育）耐前体的有关代谢物突变株选育66（1）耐“毒性”前体突变株选育n前体物达到一定浓度后，会抑制终产前体物达到一定浓度后，会抑制终产物的生物合成。物的生物合成。n例：灰黄霉素耐前体突变株的筛选例：灰黄霉素耐前体突变株的筛选n前体为氯化物，浓度由前体为氯化物，浓度由0

40、.3%提高到提高到2.0%，大幅度提高产量。，大幅度提高产量。67（2）耐前体结构类似物突变株 的选育n前体：色氨酸前体：色氨酸浓度高会抑制途径酶的合浓度高会抑制途径酶的合成，导致抗生素产量下降。成，导致抗生素产量下降。n例：例：Elandern硝吡咯菌素产生菌：硝吡咯菌素产生菌：n耐耐5-氟氟-色氨酸和色氨酸和6-氟氟-色氨酸变异菌。色氨酸变异菌。68莽草酸莽草酸分支酸分支酸磷氨基苯甲酸磷氨基苯甲酸L-色氨酸色氨酸D-色氨酸色氨酸硝吡咯硝吡咯菌素菌素2-氨基己二酸氨基己二酸二肽二肽三肽三肽-内酰胺内酰胺抗生素抗生素半胱氨酸半胱氨酸缬氨酸缬氨酸蛋氨酸蛋氨酸产量提高产量提高2-3倍倍耐耐5-5-

41、氟氟-色氨酸色氨酸耐三氯缬耐三氯缬氨酸氨酸甲氧头孢甲氧头孢菌素产量菌素产量提高提高6倍倍69（3）耐前体的有关代谢物突变株选育天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸异亮氨酸异亮氨酸丙酮酸丙酮酸缬氨酸缬氨酸丙光素丙光素 麦迪霉素麦迪霉素 4-丙酰基丙酰基素迪霉素素迪霉素 添加异亮氨酸或天门冬氨酸促添加异亮氨酸或天门冬氨酸促进麦迪霉素合成，低浓度的缬进麦迪霉素合成，低浓度的缬氨酸完全抑制麦迪霉素合成。氨酸完全抑制麦迪霉素合成。故筛选耐缬氨酸的菌株。产量故筛选耐缬氨酸的菌株。产量提高提高1.5-2倍。倍。70四、细胞膜透性突变株的选育1、营养缺陷型突变株的选育可改变细胞

42、膜、营养缺陷型突变株的选育可改变细胞膜透性透性 生物素缺陷型生物素缺陷型 油酸缺陷型油酸缺陷型 甘油缺陷型甘油缺陷型脂肪酸的合成磷脂油酸的合成磷脂甘油的合成磷脂712、温度敏感突变株选育可改变细胞膜透性、温度敏感突变株选育可改变细胞膜透性 突变位置多是发生在细胞膜结构的基因突变位置多是发生在细胞膜结构的基因上，一个碱基为另一个碱基置换，这样控上，一个碱基为另一个碱基置换，这样控制细胞壁合成的酶，在高温条件下失活，制细胞壁合成的酶，在高温条件下失活，导致细胞膜某些结构异常。导致细胞膜某些结构异常。例如：例如：TS88菌株，发酵生产谷氨酸菌株，发酵生产谷氨酸3040生物素33ug/L20g/L723、溶菌酶敏感突变株的选育可改变细胞膜、溶菌酶敏感突变株的选育可改变细胞膜透性透性 突变株为在突变株为在1mg/mL溶菌酶，不能生长。溶菌酶，不能生长。0.51246溶菌酶敏感突变株溶菌酶敏感突变株73