仪器分析原理4 1分子发光分析法课件.ppt

1、分子发光分析法分子发光分析法4.2 分子发光分析法分子发光分析法分分子子发发光光分子荧光分子荧光分子磷光分子磷光化学发光化学发光散射发光散射发光-激光拉曼光谱法激光拉曼光谱法本节主要讨论内容本节主要讨论内容生物发光生物发光4.2.1 分子荧光和分子磷光的产生分子荧光和分子磷光的产生每种物质分子都具有一系列紧密相隔的电子能级，而每每种物质分子都具有一系列紧密相隔的电子能级，而每个电子能级又包含一系列的振动能级和转动能级。当分个电子能级又包含一系列的振动能级和转动能级。当分子吸收能量子吸收能量(电能，热能，光能或化学能等）可跃迁到激电能，热能，光能或化学能等）可跃迁到激发态。分子在激发态是不稳定的

2、，很快跃迁返回到基态。发态。分子在激发态是不稳定的，很快跃迁返回到基态。在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射出来，这种现象称为出来，这种现象称为“发光发光”。1.分子的多重性分子的多重性 根据泡利不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子自根据泡利不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子自旋方向相反，即自旋配对，自旋量子数的代数和旋方向相反，即自旋配对，自旋量子数的代数和s=0,其其分子态的多重性分子态的多重性M=2s+1=1，该分子处在单重态，用符，该分子处在单重态，用符号号S表示。表示。(3)根据洪特规则，平行自旋比配对自旋更稳定。因此

3、分根据洪特规则，平行自旋比配对自旋更稳定。因此分 子的子的激发的三重态激发的三重态的能级总是比相应的的能级总是比相应的激发单重态激发单重态的的 能量略低些。能量略低些。(1)绝大多数有机分子的基态是单重态绝大多数有机分子的基态是单重态,分子吸收能量后分子吸收能量后,自旋方向不变，则分子处在自旋方向不变，则分子处在激发单重态激发单重态。S0,S1,S2分分 别表示分子的基态，第一和第二激发单重态。别表示分子的基态，第一和第二激发单重态。(2)如果跃迁到高能级的过程还伴随着电子自旋方向的改如果跃迁到高能级的过程还伴随着电子自旋方向的改 变，此时分子具有两个不配对电子变，此时分子具有两个不配对电子(

4、s=1)，则，则M=3，分，分 子处于子处于激发三重态激发三重态，用符号，用符号T来表示。来表示。T1和和T2分别表分别表 示分子的第一和第二激发三重态。示分子的第一和第二激发三重态。2.去激过程：去激有去激过程：去激有辐射跃迁辐射跃迁和和非辐射跃迁非辐射跃迁辐射跃迁辐射跃迁：放出的光子是荧光或磷光；：放出的光子是荧光或磷光；非辐射跃迁非辐射跃迁：振动驰豫、热驰豫：振动驰豫、热驰豫(内转换内转换,外转换、外转换、系间跨越等系间跨越等)跃迁方式与物质分子结构有关，也和激发时的物理跃迁方式与物质分子结构有关，也和激发时的物理和化学环境等因素有关。和化学环境等因素有关。3.分子荧光分子荧光的产生的产

5、生 分子从分子从激发单重态的最低振动能层发生激发单重态的最低振动能层发生S1S0跃迁跃迁回到回到 基态放出光子，去激发过程在基态放出光子，去激发过程在109107 s 左右的时间内。左右的时间内。4.分子磷光分子磷光的产生的产生 分子分子从激发三重态的最低振动能层从激发三重态的最低振动能层,发生发生T1S0,跃迁跃迁回到回到 基态放出光子，去激过程在基态放出光子，去激过程在10410 s 左右的长时左右的长时间内。间内。所以荧光和磷光的区别是：所以荧光和磷光的区别是：(1)荧光是由激发单重态最低振动能层跃迁到基态的各振荧光是由激发单重态最低振动能层跃迁到基态的各振 动能层的光辐射，而磷光是由激

6、发三重态的最低振动动能层的光辐射，而磷光是由激发三重态的最低振动 能层跃迁到基态的各振动能层所产生光的辐射能层跃迁到基态的各振动能层所产生光的辐射(2)三重激发态能级总是比相应的单重态激发态的能量三重激发态能级总是比相应的单重态激发态的能量 低，所以一般磷光波长较相应的荧光波长长。低，所以一般磷光波长较相应的荧光波长长。4.2.2 荧光激发光谱和荧光发射光谱荧光激发光谱和荧光发射光谱1.荧光激发光谱荧光激发光谱(荧光激发波长的选择荧光激发波长的选择)以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，绘制激以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，绘制激发光谱曲线；当荧光强度最大所对应的激发波长即为最发

7、光谱曲线；当荧光强度最大所对应的激发波长即为最适宜的激发波长。适宜的激发波长。2.荧光发射光谱荧光发射光谱(荧光或磷光发射光谱荧光或磷光发射光谱)选定激发波长后，测定不同波长下的荧光选定激发波长后，测定不同波长下的荧光(磷光磷光)强度，强度，即得到荧光即得到荧光(磷光磷光)发射光谱。发射光谱。荧光光谱具有如下特性：荧光光谱具有如下特性：斯托克斯位移：斯托克斯位移：由于振动驰豫而损失了能量，所以由于振动驰豫而损失了能量，所以 荧光波长大于激发光的波长荧光波长大于激发光的波长。荧光光谱的形状与激发光波长无关，分子的吸收谱可荧光光谱的形状与激发光波长无关，分子的吸收谱可 能有几个吸收带，但是荧光光谱

8、只有一个发射带能有几个吸收带，但是荧光光谱只有一个发射带从从 第一激发态的最低振动能级回到基态，所以第一激发态的最低振动能级回到基态，所以荧光光谱荧光光谱 和激发波长无关和激发波长无关。镜像对称：有些物质的荧光光谱和吸收光谱之间存在镜像对称：有些物质的荧光光谱和吸收光谱之间存在 “镜像对称镜像对称”关系。关系。feIK I Clf吸收的光子数发射的光子数f4.2.3 分子荧光参数分子荧光参数1.荧光强度荧光强度I(某特定荧光波长的强度某特定荧光波长的强度)荧光强度荧光强度I 和荧光物质的浓度成正比，这是荧光定量分和荧光物质的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。析的基础。式中式中K为仪器的常数为

9、仪器的常数,Ie为激发光的强度为激发光的强度,为荧光物质的为荧光物质的吸收系数吸收系数,C为荧光物质的浓度为荧光物质的浓度,l 为吸收光程为吸收光程,为荧光为荧光的量子产率。的量子产率。指荧光光谱在指荧光光谱在所有波长处的荧光强度所有波长处的荧光强度之和。用荧光之和。用荧光光谱的面积来表示荧光总量。利用荧光总量来进行荧光光谱的面积来表示荧光总量。利用荧光总量来进行荧光定量分析，可以定量分析，可以提高方法的灵敏度提高方法的灵敏度。3.荧光寿命荧光寿命 荧光强度降到最大强度的荧光强度降到最大强度的1/e所需要的时间，常用所需要的时间，常用表示。一般表示。一般t=时已有时已有63%的受激分子已衰变了

10、。不同的受激分子已衰变了。不同的荧光物质荧光寿命不同，所以，可以利用荧光寿命的的荧光物质荧光寿命不同，所以，可以利用荧光寿命的进行荧光混合物分析。进行荧光混合物分析。jffk kk4.2.4 荧光和分子结构荧光和分子结构荧光分子的结构特点：荧光分子的结构特点：对激发光具有强吸收；对激发光具有强吸收；荧光发射的速率比其它非辐射跃迁速率大，即荧光量荧光发射的速率比其它非辐射跃迁速率大，即荧光量子产率大，可用各个跃迁过程的速率常数表示荧光的量子子产率大，可用各个跃迁过程的速率常数表示荧光的量子产率：产率：(kf为荧光发射的速率常数，为荧光发射的速率常数，kj为其它各过程的速率常数之和为其它各过程的速

11、率常数之和)其中其中 kf取决于分子的化学结构取决于分子的化学结构,而而kj取决于分子所处的化取决于分子所处的化学环境。若学环境。若kfkj时，即使该物质具有很大吸光系数，时，即使该物质具有很大吸光系数，也不会产生荧光也不会产生荧光(磷光磷光)。1.有机化合物的荧光有机化合物的荧光(三类有机化合物具有强荧光三类有机化合物具有强荧光)共轭体系越大共轭体系越大,键电子非定域键电子非定域(即流动性即流动性)越大越大,越容易被激越容易被激发，荧光也越容易发生。所以发，荧光也越容易发生。所以或或化合物有较强的化合物有较强的荧光，芳环越大，荧光强度也越强荧光，芳环越大，荧光强度也越强。(2)分子为刚性的平

12、面结构分子为刚性的平面结构可以减少分子自身的振动，使分子与溶可以减少分子自身的振动，使分子与溶剂或其它溶质刚性的平面结构的相互作用减少，降低剂或其它溶质刚性的平面结构的相互作用减少，降低了碰撞去激发的可能性，了碰撞去激发的可能性，。COCOOOOOOCOOCCH OHH C CH3 32荧光黄荧光黄 发荧光发荧光 酚酞酚酞 不发荧光不发荧光萘萘 荧光强荧光强 维生素维生素A 荧光弱荧光弱(3)取代基效应取代基效应 苯环上不同的取代基及取代基位置对该化合物的荧光苯环上不同的取代基及取代基位置对该化合物的荧光强度和荧光光谱有较强的影响。强度和荧光光谱有较强的影响。给电子取代基加强荧光给电子取代基加

13、强荧光 如如:NH2、NHR、NR2、OH、OR、CN等；等；得电子基取代基一般将使荧光减弱，使磷光加强得电子基取代基一般将使荧光减弱，使磷光加强 如如:羰基羰基(C=O、COOH、)，硝基，硝基(NO2)和重氮和重氮 基等；基等；重原子取代，即卤素取代，芳烃取代上卤素之后，重原子取代，即卤素取代，芳烃取代上卤素之后，其化合物的荧光随卤素原子量增加而减弱，而磷光其化合物的荧光随卤素原子量增加而减弱，而磷光 则相应地增强。则相应地增强。取代基位置：对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制取代基位置：对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制 荧光。荧光。含氮杂环化合物：杂环化合物分子有含氮杂环化合物：杂环

14、化合物分子有N、O、S原子原子(非键非键 电子电子n)，激发跃迁属，激发跃迁属n*类型，吸光系数小；在低温和类型，吸光系数小；在低温和 极性溶剂中有较强的磷光；极性溶剂中有较强的磷光；溶剂的极性溶剂的极性荧光强度荧光强度2.无机物的荧光无机物的荧光-比较简单比较简单 (1)无机盐的荧光：无机盐的荧光：一般一般 镧系元素的三价离子和锕系元镧系元素的三价离子和锕系元素中的素中的 铀的无机盐有荧光，是由铀的无机盐有荧光，是由5d电子或电子或 4f电子跃迁而电子跃迁而发射的，谱线比较窄；发射的，谱线比较窄；(2)不发荧光的无机离子和有吸光结构的有剂机试剂进不发荧光的无机离子和有吸光结构的有剂机试剂进行

15、配合反应，将行配合反应，将n*跃迁变为跃迁变为*，使有机配合体的，使有机配合体的非刚性非刚性为刚性的结构为刚性的结构荧光荧光 配位化合物。如配位化合物。如8-羟基喹啉，羟基喹啉，罗丹明类染料是常用的金属离子显色剂。罗丹明类染料是常用的金属离子显色剂。另外，二元配合物和三元配合物的产生荧光的详细情另外，二元配合物和三元配合物的产生荧光的详细情况可自学看书。况可自学看书。4.2.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素1.溶剂的影响溶剂的影响 取决溶剂分子和荧光分子的相互作用，作用不同，取决溶剂分子和荧光分子的相互作用，作用不同，效果完全不同。效果完全不同。非极性荧光物质：溶剂的极性非极性荧光物质

16、：溶剂的极性荧光强度荧光强度，而荧光峰位红移；而荧光峰位红移；极性荧光物质：溶剂的极性影响偶极矩，效果完全极性荧光物质：溶剂的极性影响偶极矩，效果完全 相反。相反。2.温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响：荧光强度对温度很敏感，荧光强度对温度很敏感，温度温度荧光强度荧光强度 温度升高增加了荧光分子和溶剂分子的热运动，从温度升高增加了荧光分子和溶剂分子的热运动，从而增加两者之间的碰撞频率，使外转换去激过程增大。而增加两者之间的碰撞频率，使外转换去激过程增大。在低温条件下，荧光强度有显著增强。在低温条件下，荧光强度有显著增强。溶液的溶液的pH值主要影响荧光物质存在的形式，值主要影响荧光物质存在

17、的形式，所以所以要严格控制溶液的要严格控制溶液的pH值。值。溶液中存在一种吸收荧光的物质，起着滤光片的作溶液中存在一种吸收荧光的物质，起着滤光片的作 用，使荧光强度减弱。又称为自吸收。用，使荧光强度减弱。又称为自吸收。4.2.6 荧光猝灭荧光猝灭引起荧光强度降低，称为荧光猝灭，使荧光强度下降的引起荧光强度降低，称为荧光猝灭，使荧光强度下降的物质称为猝灭剂。物质称为猝灭剂。1.碰撞猝灭碰撞猝灭：碰撞是荧光猝灭的主要原因。碰撞是荧光猝灭的主要原因。一般，猝灭剂浓度一般，猝灭剂浓度猝灭作用猝灭作用；粘度粘度猝灭作用猝灭作用；温度温度碰撞碰撞 猝灭作用猝灭作用。2.化合作用猝灭化合作用猝灭：荧光物质和

18、猝灭剂生成非荧光的配荧光物质和猝灭剂生成非荧光的配 合物，就是一种化合作用的猝灭合物，就是一种化合作用的猝灭荧光物质完全荧光物质完全 改变了。改变了。3.转入三重态猝灭转入三重态猝灭 荧光分子是处在单重激发态时的去激过程，分子进荧光分子是处在单重激发态时的去激过程，分子进入了三重态后在常温下不发荧光。有些条件会诱变使荧入了三重态后在常温下不发荧光。有些条件会诱变使荧光分子从单重激发态向三重激发态跃迁，而使荧光猝灭。光分子从单重激发态向三重激发态跃迁，而使荧光猝灭。4.荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 在在高浓度高浓度的荧光物质溶液中，荧光强度因其浓度高的荧光物质溶液中，荧光强度因其浓度高而减弱

19、称为而减弱称为自猝灭（碰撞自猝灭（碰撞）。如蒽和苯的自猝灭便是其。如蒽和苯的自猝灭便是其例。例。4.2.7 化学发光和生物发光分析化学发光和生物发光分析 受化学能的激发，使分子处在激发态，称为化学发光；受化学能的激发，使分子处在激发态，称为化学发光；此过程发生在生物体系中就称为生物发光。此过程发生在生物体系中就称为生物发光。1.化学发光的基本原理化学发光的基本原理 化学发光过程可以用下述反应式表示：化学发光过程可以用下述反应式表示：A+B C*+D 化学激发化学激发 C*C+h 化学发光化学发光化学发光反应的要求化学发光反应的要求:(1)反应应提供足够的激发能（反应应提供足够的激发能（150

20、300 KJ mol1），），并且具有一定的速度，大多数氧化还原反应满足上述并且具有一定的速度，大多数氧化还原反应满足上述 条件条件,所以化学发光反应多是氧化所以化学发光反应多是氧化 还原反应。还原反应。(2)反应过程中至少一种激发态分子产生，芳香族化合反应过程中至少一种激发态分子产生，芳香族化合 物和羰基化合物容易生成激发态产物。物和羰基化合物容易生成激发态产物。(3)激发态分子不能以热的形式消耗能量，只能以释放激发态分子不能以热的形式消耗能量，只能以释放 光子的形式回到基态。光子的形式回到基态。化学发光定量分析的依据：化学发光定量分析的依据：Ic(t)=c (dCA/dt)式中的式中的Ic

21、(t)表示在反应进行到表示在反应进行到t时的化学发光强度；时的化学发光强度；c为化学发光效率，它与特定的化学发光有关；为化学发光效率，它与特定的化学发光有关；(dCA/dt)为分析物为分析物A参加反应的速率。参加反应的速率。如果反应是一级动力学反应如果反应是一级动力学反应,化化学发光强度与同一时刻的分析学发光强度与同一时刻的分析物物A的浓度成正比的浓度成正比;化学发光强化学发光强度随反应时间增加而迅速下降度随反应时间增加而迅速下降(如图如图)，定量以峰值，定量以峰值(或总的发或总的发光强度光强度)与被分析物的浓度成线与被分析物的浓度成线性关系。性关系。化学发光强度时间2.化学发光反应类型化学发

22、光反应类型 (1)气相化学发光气相化学发光 气相化学发光反应主要有气相化学发光反应主要有O3、NO 和和S的化学发光反应。可以用于监测空气中的的化学发光反应。可以用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2 和和CO等。等。(2)液相化学发光液相化学发光 用于液相化学发光的物质有鲁米诺用于液相化学发光的物质有鲁米诺 (Lominol)、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧化草、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧化草 酸盐、硅氧烯和芳香游离基离子等。酸盐、硅氧烯和芳香游离基离子等。(3)生物发光分析生物发光分析 生物发光反应常涉及到催化反应和发光反应。这类反生物发光反应常涉及到催化反应和发光反应。这类反 应选择性很好，而且有很高的灵敏度。应选择性很好，而且有很高的灵敏度。三磷酸腺苷三磷酸腺苷(ATP)的测定就是一个十分成功的实例。在的测定就是一个十分成功的实例。在 pH78的介质中，在荧光素酶的介质中，在荧光素酶(E)和和Mg()的存在条件的存在条件 下，让荧光素下，让荧光素(LH2)与与ATP反应，生成磷酸腺苷反应，生成磷酸腺苷(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐。荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐。