酶工程酶和细胞的固定化课件.pptx

1、酶工程酶和细胞的固定化（优选）酶工程酶和细胞的固（优选）酶工程酶和细胞的固定化定化果葡糖浆：葡萄糖异构果葡糖浆：葡萄糖异构酶酶/木糖异构酶木糖异构酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶异麦芽酮糖：蔗糖变位酶阿斯巴甜：嗜热菌蛋白酶阿斯巴甜：嗜热菌蛋白酶6-氨基青霉烷酸（氨基青霉烷酸（6-APA）：）：青霉素酰化酶青霉素酰化酶7-氨基头孢烷酸（氨基头孢烷酸（7-ACA）：）：D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶苯乙醇胺（又用作苯乙醇胺（又用作瘦肉精）：脂肪酶瘦肉精）：脂肪酶丙烯酰胺：腈水解酶丙烯酰胺：腈水解酶氨基酸：氨基氨基酸：氨基酰化酶酰化酶/酰脲酶酰脲酶果葡糖浆果葡糖浆葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶青霉素酰化酶青霉素酰化

2、酶 6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸Immobilization,Why？EnzymepropertiesImmobilized Enzyme or cell？Carrier properties Immobilized effectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicity Contents of chapter 44.2 固定化的载体和方法4.3 固定化酶的性质GoGo4.1 固定化的目的和定义Go4.4 应用实例Go4.14.1 固定化的目的和定义固定化的目的和定义Why？成本高成本高生产过程生产过程难以连续难以连续 产物

3、分离产物分离困难困难利用率低利用率低稳定性差稳定性差反应过程反应过程难以控制难以控制游离酶游离酶/细胞细胞:Why？成本成本反复反复/连续连续生产过程生产过程 产物分离产物分离容易容易利用率利用率稳定性稳定性固定化酶固定化酶/细胞细胞:反应过程反应过程易控制易控制 固定化酶固定化酶/细胞技术是指利用细胞技术是指利用物理或化学特定的手物理或化学特定的手段段，将游离的酶或细胞，将游离的酶或细胞定位定位，或，或限制限制于特定的空间于特定的空间区域，使其区域，使其保持催化活性保持催化活性，并可，并可反复使用反复使用的技术。的技术。定义定义固定化酶固定化酶酶需要分离纯化；酶需要分离纯化；酶活力有损失；酶

4、活力有损失；不适合多酶反应；不适合多酶反应；催化效率高，节省空间催化效率高，节省空间固定化细胞固定化细胞无需酶的分离纯化无需酶的分离纯化酶活损失小，更稳定酶活损失小，更稳定多酶体系，无需辅酶再生多酶体系，无需辅酶再生生产成本低生产成本低4.24.2 固定化的载体和方法固定化的载体和方法Carriers化学性质要求化学性质要求亲水性亲水性/疏水性疏水性膨胀系数膨胀系数低低稳定性稳定性高高形态学性质要求形态学性质要求粒径小，粒度分布窄粒径小，粒度分布窄内表面积内表面积大大孔径孔径足够大足够大机械性质要求机械性质要求耐压性耐压性高高可压缩性可压缩性低低弹性弹性足够足够其他要求其他要求来源来源广泛广泛

5、成本成本低低食品级（用于食品工业）食品级（用于食品工业）载体孔径大于酶载体孔径大于酶分子大小，以保分子大小，以保证酶构象的自由证酶构象的自由变化，提高酶活，变化，提高酶活，降低空间位阻。降低空间位阻。被吸附到空穴内壁的酶分子被吸附到空穴内壁的酶分子Eupergit C孔径孔径10-20nm酶活力较低酶活力较低依赖于孔径依赖于孔径Eupergit 250L孔径孔径100nm酶活力高酶活力高酶负载高酶负载高载体孔径及分布载体孔径及分布扩散限制可以克服时，扩散限制可以克服时，载体最小孔径是多少？载体最小孔径是多少？rp20+de一般最小孔径一般最小孔径 2rp=40+2de酶直径酶直径de孔半径孔半

6、径rp若酶分子直径若酶分子直径5nm，最，最小载体孔径应为小载体孔径应为50nm孔径、比表面积、酶负载量的关系孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中该图中随孔径增大随孔径增大，酶，酶所占据的所占据的内表面积越小内表面积越小，酶负载量越小。酶负载量越小。固定化酶的固定化酶的比活力比活力起初起初随孔径增大而减小；载随孔径增大而减小；载体孔径大于体孔径大于60nm时，酶时，酶活力增加，说明扩散限活力增加，说明扩散限制越来越小。制越来越小。菊糖酶菊糖酶固定在可控孔的固定在可控孔的二氧化硅载体上二氧化硅载体上无机载体无机载体高压稳高压稳定性定性搅拌器中搅拌器中易受磨损易受磨损vs多孔玻璃多孔玻璃SiO2硅

7、藻土硅藻土 SiO2斑脱土斑脱土(膨润土膨润土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶青霉素酰化酶/1g斑脱土斑脱土无机载体无机载体应用应用功能基团功能基团制造商制造商多孔玻璃多孔玻璃SiO2实验室实验室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅胶多孔硅胶 SiO2工业规模工业规模-OHGrace(USA)（商品名（商品名Deloxan）Solvay(D)Degussa(D)明矾硅石明矾硅石-OH介孔分子筛介孔分子筛MCM-41实验室实验室有机载体有机载体天然高分子，如多糖类天然高分子，如多糖类与蛋白质的与蛋白质的相容性较好相容性较好琼脂糖琼脂糖

8、宽网状，亲水性，宽网状，亲水性，与酶作用弱，酶不易失活与酶作用弱，酶不易失活纤维素纤维素功能化：功能化：CM(羧甲基羧甲基)-纤维素纤维素DEAE(二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基)-纤维素纤维素工业：工业：DEAE-纤维素用于纤维素用于葡萄糖异构酶固定化，葡萄糖异构酶固定化，1986葡聚糖葡聚糖机械稳定性机械稳定性低，来源受限低，来源受限水溶性，实验室水溶性，实验室实验室实验室有机载体有机载体合成聚合物载体合成聚合物载体化学和机械化学和机械稳定性高稳定性高性能优良性能优良操作简单操作简单离子交换树脂离子交换树脂聚甲基丙烯酸衍生物聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非

9、水系统反应固定化脂肪酶催化非水系统反应新型载体新型载体磁性高分子微球磁性高分子微球高分子复配载体：高分子复配载体：两种及以上高分子体系，经氢两种及以上高分子体系，经氢键、疏水作用等次级键聚集，键、疏水作用等次级键聚集，生物相容，传质性能好。生物相容，传质性能好。海藻酸+聚丙烯，聚乙烯亚胺-卡拉胶，硅胶-海藻酸钙聚合物纳米凝胶包埋辣根过聚合物纳米凝胶包埋辣根过氧化物酶，提高稳定性，保氧化物酶，提高稳定性，保持酶在有机溶剂中的活力持酶在有机溶剂中的活力纳米载体纳米载体介孔磁性载体固定化微生物用于污水处理，COD去除率可达82.7%微胶囊（半透膜）微胶囊（半透膜）凝胶凝胶 Methods包埋（可溶形

10、式）包埋（可溶形式）载体固定化载体固定化 交联交联 通过化学键与载体连接通过化学键与载体连接 吸附吸附 离子键结合离子键结合 配位结合配位结合 共价结合共价结合 (1)吸附法吸附法1916年年 Nellson&Griffin 木炭固定蔗糖酶木炭固定蔗糖酶简易，可逆性简易，可逆性载体重复使用载体重复使用避免化学修饰避免化学修饰保持酶活保持酶活酶吸附固定化的不同方法酶吸附固定化的不同方法离子吸附离子吸附生物特异性生物特异性非特异性非特异性配位配位疏水作用疏水作用pH 7.07.5氨基酰化酶酶液氨基酰化酶酶液0.05mol/L NaOH，水洗涤，水洗涤 DEAE-Sephadex A251g/60m

11、L酶液酶液冷库搅拌冷库搅拌吸附过夜吸附过夜 吸去上清液吸去上清液4备用备用水，醋酸钠溶液洗水，醋酸钠溶液洗涤固定化酶涤固定化酶活力回收：活力回收：50%60%；600800 mol/(h g)湿固定化酶湿固定化酶最早应用最早应用于工业化于工业化的固定化酶的固定化酶(2)共价法共价法A-活性氨基酸残基；活性氨基酸残基；B-载体上的官能团载体上的官能团C-载体；载体；D-间隔臂间隔臂酶与载体连接牢固，酶与载体连接牢固，稳定性高，但酶易失活稳定性高，但酶易失活不同氨基酸残基的不同氨基酸残基的活性官能团活性官能团载体的结合官能团载体的结合官能团酶的结合官能团酶的结合官能团天然高分子载体天然高分子载体人

12、工合成高聚物载体人工合成高聚物载体载体与酶的载体与酶的共价结合模式共价结合模式1 重氮化重氮化 2 叠氮化叠氮化3 烷基化和芳基化烷基化和芳基化4 溴化氰溴化氰 5 Schiff碱碱6 Ugi反应反应 7 酰胺化酰胺化8 巯基巯基-二硫键变换反应二硫键变换反应9 Mercury-酶相互作用酶相互作用10 氧化氧化 11 肽键肽键载体的结载体的结合官能团合官能团酶的结合酶的结合官能团官能团载体需载体需事先活化事先活化重氮化反应重氮化反应举例：含举例：含-NH2载体载体与异硫氰酸反应与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基参与反应酪氨酸的酚基参与反应用于固

13、定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶举例：含举例：含-COOH载体载体,如如CMC酶中游离氨基酶中游离氨基参与反应参与反应与琥珀酰亚胺反应与琥珀酰亚胺反应与氯化亚砜反应与氯化亚砜反应举例：含举例：含-COOH载体载体,如如CMC与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、巯基、羟基、酚巯基、羟基、酚羟基反应羟基反应叠氮化反应叠氮化反应酯化酯化酰肼衍生物酰肼衍生物叠氮衍生物叠氮衍生物举例：含举例：含-OH载体载体,如多糖如多糖与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、羟基反应羟基反应与溴化氰反应与溴化氰反应活泼的活泼的亚胺碳酸酯亚胺碳酸酯条件条件温和温

14、和举例：含举例：含-OH载体载体,如多糖如多糖与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、羟基、巯基反应羟基、巯基反应与三氯均三嗪反应与三氯均三嗪反应磺酰化反应磺酰化反应环氧化反应，如环氧化反应，如Eupergit 举例：含硅无机载体举例：含硅无机载体方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白），方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法或用表面聚合法“镀上镀上”一层聚合物，再对包覆后的表面活化一层聚合物，再对包覆后的表面活化方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基蒸馏水蒸馏水 1mL,1mol/L HCl 1mL，5%NaNO2 1m

15、LABSE-交联交联琼脂琼脂 3g 冰水浴，冰水浴，15min，洗去，洗去NO2-4备用备用1mol/L Na2CO3调节调节pH 7.0，冰水浴，冰水浴2hABSE-交联交联琼脂固定化碱琼脂固定化碱性磷酸酯酶性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶约碱性磷酸酯酶约300u，BSA 20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液溶液重氮盐重氮盐ABSE：对氨基苯磺酰乙基：对氨基苯磺酰乙基(3)包埋法包埋法不涉及化学修饰，条件不涉及化学修饰，条件温和，酶活力回收率高温和，酶活力回收率高A.凝胶包埋法：凝胶包埋法：酶分子包在高聚物格子中酶分子包在高聚物格子中i.天然凝胶包埋法天然凝胶包埋法海藻酸钠海藻酸钠+细胞细胞

16、+酶酶CaClCaCl2 2溶液溶液其他天然凝胶：其他天然凝胶：明胶、明胶、琼脂凝胶、琼脂凝胶、卡拉胶等卡拉胶等喷射切割器喷射切割器注射方法得注射方法得藻酸盐球珠藻酸盐球珠喷射切割器喷射切割器 得得藻酸盐球珠藻酸盐球珠ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋 网格型网格型丙烯酰胺丙烯酰胺 BIS BIS：N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺 美国Altus公司已上市10个产品，年利润百万美元。影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.Cornin

17、g，Valio，Suminoto，Snam ProgettiExamples：甜味剂工业酶分子包在高聚物格子中界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。异麦芽酮糖：蔗糖变位酶用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶n-丁醇 4200m3D-间隔臂如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。1.酶酶2.单体单体+交联剂交联剂3.起始剂起始剂4.搅拌分散搅拌分散1.酵母乳糖酶酵母乳糖酶（100mg）溶）溶于于56mL磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（pH7.3）2.丙烯酰胺单丙烯酰胺单体体 1530%BIS交联剂交联剂5%3.起始剂：起始剂：

18、0.6mL TEMED，200mg过硫过硫酸铵缓冲液酸铵缓冲液4.1mL 失水失水山梨醇半油酸山梨醇半油酸酯，酯，400mL甲甲苯苯-氯仿氯仿固定化酶颗粒固定化酶颗粒 100200m珠状聚丙烯酰胺包埋珠状聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法氮气，氮气，4，30minBIS：N,N-亚甲基双丙烯酰胺；亚甲基双丙烯酰胺；TEMED：四甲基乙二胺：四甲基乙二胺搅拌分散搅拌分散1.酶酶2.单体单体+交联剂交联剂3.起始剂起始剂1.1kg 湿重湿重E.coli悬浮于悬浮于2L 0.9%NaCl，82.丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体 750g，BIS交联交联剂剂2.

19、4L，8聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌（天冬氨酸酶）（天冬氨酸酶）3.100mL-二甲基氨基丙腈，二甲基氨基丙腈，500mL，1%过硫酸钾（起始剂）过硫酸钾（起始剂）2025到到30时冰水时冰水迅速冷却迅速冷却凝胶切成凝胶切成34mm3的立方体的立方体ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法1520min来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基）被四甲氧基硅烷（硅烷（TMOS）溶胶）溶胶-凝胶固定化后活力回收凝胶固定化后活力回收30%，与溶液酶相比，稳定性提高。与溶液酶相比，稳定性提高。iii.溶胶溶胶-凝胶包埋法凝胶包埋法 将无机硅源

20、前驱体与酶混合，将无机硅源前驱体与酶混合，水解、水解、缩合缩合反应，得透明反应，得透明溶胶溶胶，经陈化、，经陈化、聚合形成聚合形成多孔凝胶多孔凝胶，即得固定化酶，即得固定化酶B.微囊化：微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内以物理方式将酶包封于半透膜内微囊内径几微米微囊内径几微米-几百微米，酶关在不同构型半几百微米，酶关在不同构型半透膜外壳内，小分子自由进出，避免酶失活透膜外壳内，小分子自由进出，避免酶失活。酶被胶囊膜限制在内部，底物或产物可以自由扩散。酶被胶囊膜限制在内部，底物或产物可以自由扩散。微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等界面沉淀法界面沉淀法制备微胶囊制备

21、微胶囊乳化乳化油包水油包水的微滴的微滴加入高聚物加入高聚物高聚物在油水界高聚物在油水界面上沉淀、析出，面上沉淀、析出，将酶包埋将酶包埋微胶囊制备方法微胶囊制备方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。而形成的薄膜将酶包埋。界面聚合法：亲水性单体界面聚合法：亲水性单体 +疏水性单体在界面发生疏水性单体在界面发生聚合将酶包埋。聚合将酶包埋。二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次级乳化液，而后将聚合物溶液固化。于水中形成次级乳化液，而后将聚合物溶液固化。脂质体包埋法：

22、类似于脂质体包埋法：类似于“细胞质膜细胞质膜”式的结构。式的结构。聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合。作用结合。(4)交联法交联法利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功能利用双功能试剂进行酶之间的交联，使酶分子和双功能试剂间形成共价键，得到三维交联网架结构。试剂间形成共价键，得到三维交联网架结构。常用的交联试剂常用的交联试剂戊二醛（戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（己二胺（hexamethylenediamine顺丁烯二酸酐（顺丁烯二酸酐（maleic anhydride）A.酶分子之间的交联酶分子之间的交联B.

23、酶与水不溶性载体交联酶与水不溶性载体交联A.酶分子间的戊二醛交联：酶分子间的戊二醛交联：氨基的交联反应氨基的交联反应交联时的交联时的 pH 值一般与酶的等电点值一般与酶的等电点 pI 相同相同交联酶晶体交联酶晶体CLEC：将纯酶晶体进行交联，底物：将纯酶晶体进行交联，底物和产物扩散通过和产物扩散通过2-5nm微孔通道进行。微孔通道进行。高纯度、高活性、高生产效率高纯度、高活性、高生产效率 如：核糖核酸酶如：核糖核酸酶A A、枯草芽孢杆菌蛋白酶、羧肽酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、羧肽酶B B以及醇脱氢酶的交联酶晶体。以及醇脱氢酶的交联酶晶体。美国美国AltusAltus公司已上市公司已上市1010个产

24、品，年利润百万美元个产品，年利润百万美元。交联酶聚集体交联酶聚集体CLEA：通过合适的沉淀剂，如：通过合适的沉淀剂，如：硫酸铵、叔丁醇和硫酸铵、叔丁醇和PEG将酶沉淀，同时保留活性将酶沉淀，同时保留活性可达可达100%，然后用戊二醛交联。，然后用戊二醛交联。2.5%戊二醛溶液戊二醛溶液2mL胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 500mg溶于溶于5mL 0.2mol/L pH6 醋酸缓冲液醋酸缓冲液搅拌搅拌13h凝胶在匀浆器凝胶在匀浆器内粉碎内粉碎检测检测A280水洗去游离水洗去游离戊二醛和酶戊二醛和酶戊二醛交联戊二醛交联胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶戊二醛终浓度戊二醛终浓度0.30.6%得最得最好的活力回收好

25、的活力回收B.酶与载体交联：酶与载体交联：采用交联剂将酶分子偶联到水不溶性载体上，形成水不溶采用交联剂将酶分子偶联到水不溶性载体上，形成水不溶性的固定化酶。性的固定化酶。交联酶的特性：交联酶的特性：a.交联得到的固定化酶交联得到的固定化酶/固定化菌体结合牢固，酶很固定化菌体结合牢固，酶很难脱落，可长期使用。难脱落，可长期使用。b.交联反应条件剧烈，而且交联需酶分子中的多个基交联反应条件剧烈，而且交联需酶分子中的多个基团同时参与，致使酶活力损失较大团同时参与，致使酶活力损失较大c.制成的固定化酶制成的固定化酶/菌体颗粒较小菌体颗粒较小双重固定化法双重固定化法包埋包埋+交联交联吸附吸附+交联交联传

26、统固定化方法的比较传统固定化方法的比较特征特征载体结合法载体结合法交联法交联法包埋法包埋法离子吸离子吸附法附法物理吸附物理吸附法法共价结合共价结合法法制备制备易易易易难难中中较难较难结合力结合力中中弱弱强强强强强强酶活性酶活性高高高高中或低中或低低低高高载体再生性载体再生性较容易较容易容易容易难难不能再生不能再生不能再生不能再生底物专一性底物专一性不变不变不变不变可变可变可变可变不变不变稳定性稳定性中中低低高高高高高高固定化成本固定化成本低低低低高高中中中或高中或高抗微生物能力抗微生物能力无无无无无无可能可能较强较强(5)非传统固定化方法非传统固定化方法修饰修饰-吸附法吸附法如：单甲氧基如：单

27、甲氧基PEG(1900)以以NPCF（氯甲酸对硝基（氯甲酸对硝基苯酯）活化，使苯酯）活化，使玫瑰假丝酵母脂酶玫瑰假丝酵母脂酶PEG化，增加酶活。化，增加酶活。ToTo：酶难以吸附在载体，或吸附量低：酶难以吸附在载体，或吸附量低吸附吸附-包埋法包埋法如：两步法来自如：两步法来自放线菌的青霉素放线菌的青霉素V酰基转移酶酰基转移酶固定：固定：a.酶吸附于硅藻土，酶吸附于硅藻土，b.包埋于聚丙烯酰胺凝胶包埋于聚丙烯酰胺凝胶如：来自如：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可稳定固定化（可稳定21天）：天）：a.吸附于糊化的玉米淀粉上，吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸盐纤维中。包埋于藻酸

28、盐纤维中。To：酶容易从载体表面脱离：酶容易从载体表面脱离吸附吸附-交联法交联法如：如：青霉素青霉素G酰基转移酶酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、苯氧乙酰纤维素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等苯氧乙酰纤维素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同载体上，再用戊二醛交联。在不同载体上，再用戊二醛交联。在60下稳定性比自下稳定性比自由酶提高由酶提高10倍以上。倍以上。To：酶容易流失，稳定性差：酶容易流失，稳定性差4mL 碱性蛋白酶液碱性蛋白酶液离子交换树脂离子交换树脂 Dower MWA-11g,用多种缓冲液洗涤用多种缓冲液洗涤pH 6.51%戊二醛溶戊二醛溶液液活力回收

29、率活力回收率27%过滤，过滤，磷酸钾缓冲液洗涤磷酸钾缓冲液洗涤吸附交联法固定吸附交联法固定碱性蛋白酶碱性蛋白酶0，1h修饰修饰-包埋法包埋法酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共轭物再被包埋进凝胶基质中。共轭物再被包埋进凝胶基质中。如：如：天然牛血清胺氧化酶天然牛血清胺氧化酶PEG化，再与水凝胶作用化，再与水凝胶作用 To：包埋酶流失：包埋酶流失修饰后固定化修饰后固定化 额外电荷的引入额外电荷的引入 氨基酸残基的互换氨基酸残基的互换 疏水性的改变疏水性的改变 不饱和键的引入不饱和键的引入 提高有机溶剂中溶解度提高有机溶剂中溶解度 环节支持

30、物表面的毒性环节支持物表面的毒性如：疏水的酰亚胺酯如：疏水的酰亚胺酯修饰修饰酵母醇脱氢酶酵母醇脱氢酶，可定量吸附在可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。多聚体小珠上。固定化酶化学后处理固定化酶化学后处理如：固定在如：固定在CNBr活化琼脂糖上的活化琼脂糖上的黑曲霉的黑曲霉的-葡萄葡萄糖苷酶糖苷酶的热稳定性，在经该酶的糖链氨烷化后，的热稳定性，在经该酶的糖链氨烷化后，借助戊二醛的交联，得到明显改进。借助戊二醛的交联，得到明显改进。4.34.3 固定化酶的性质固定化酶的性质Properties固定化酶固定化酶活力活力固定化酶固定化酶稳定性稳定性固定化酶固定化酶底物特异性底物特异性最适温度最适温度最适

31、最适pH值值固定化酶的活力固定化酶的活力固定化酶活力固定化酶活力一般低于天然酶一般低于天然酶a.固定化载体与酶的相互作用引起酶活性中心固定化载体与酶的相互作用引起酶活性中心或调解中心的构象发生了改变，甚至影响了或调解中心的构象发生了改变，甚至影响了活性中心的氨基酸，从而导致酶活力下降；活性中心的氨基酸，从而导致酶活力下降；b.固定化载体增加了酶分子的活性中心与反应固定化载体增加了酶分子的活性中心与反应底物之间的阻力（载体空隙太小或固定化方底物之间的阻力（载体空隙太小或固定化方式与位置不当），使得底物无法和酶接触，式与位置不当），使得底物无法和酶接触，影响对底物的定位作用，从而降低酶活力；影响对

32、底物的定位作用，从而降低酶活力；固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性a.固定化后酶分子与载体固定化后酶分子与载体 多点连接，防止酶分子多点连接，防止酶分子 伸展变形；酶分子失去了伸展变形；酶分子失去了 分子间相互作用的机会，分子间相互作用的机会，抑制了降解，提高了酶的稳定性，保存时间延长。抑制了降解，提高了酶的稳定性，保存时间延长。固定化酶稳定性（热固定化酶稳定性（热稳定性、储存稳定性、稳定性、储存稳定性、操作稳定性）一般高操作稳定性）一般高于天然酶于天然酶c.影响因素：交联剂、介质、温度，影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓，离子强度，缓冲液种类，添加剂等冲液种类，添加剂等b.对蛋白

33、酶抵抗性增强，对变性剂（如尿素、有机溶剂、对蛋白酶抵抗性增强，对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）耐受性提高，保留较高酶活力；对酶抑制盐酸胍等）耐受性提高，保留较高酶活力；对酶抑制剂、对不同剂、对不同 pH 值的稳定性提高值的稳定性提高固定化酶的底物特异性固定化酶的底物特异性a.固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关。固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关。b.作用于低分子量底物的酶，特异性无明显变化作用于低分子量底物的酶，特异性无明显变化（如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等）。（如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等）。c.既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物既可作用于大分子底物，又可作用于

34、小分子底物的酶，特异性往往会发生变化。的酶，特异性往往会发生变化。例：固定在羧甲基纤维素上的例：固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶胰蛋白酶，对二肽或多肽的作，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的降解活力仅为游离酶的用保持不变，而对酶蛋白的降解活力仅为游离酶的 3%左右左右原因：载体的空间位阻作用，大分子底物难于接近酶分子原因：载体的空间位阻作用，大分子底物难于接近酶分子固定化酶的最适温度固定化酶的最适温度a.与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化不与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化不大，部分酶固定化后最适温度发生明显变化。大，部分酶固定化后最适温度发生明显变化。例例1：利用重氮化法制备

35、固定化：利用重氮化法制备固定化胰蛋白酶和胰凝胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶乳蛋白酶，最适温度比游离酶高出，最适温度比游离酶高出 510摄氏摄氏度。度。例例2：色氨酸酶色氨酸酶与载体共价结合之后，最适温度与载体共价结合之后，最适温度比游离酶高比游离酶高 515摄氏度。摄氏度。b.不不同方法固定化同一种酶，最适温度可能不同。同方法固定化同一种酶，最适温度可能不同。例例：氨基酰化酶：氨基酰化酶（游离酶最适（游离酶最适 60 摄氏度）摄氏度）i 用用 DEAE-葡聚糖凝胶为离子结合载体得到的固定葡聚糖凝胶为离子结合载体得到的固定化酶最适温度为化酶最适温度为 72 摄氏度；摄氏度；ii 用用 DEAE-纤维素结

36、合后，最适温度为纤维素结合后，最适温度为 67摄氏度；摄氏度；Iii 用烷基化共价结合后，最适温度比游离酶有所下用烷基化共价结合后，最适温度比游离酶有所下降。降。固定化酶的最适固定化酶的最适pH值值a.酶固定化后最适酶固定化后最适 pH 值一般会发生变化，值一般会发生变化，主要取决于固定化酶所处的微环境的性质主要取决于固定化酶所处的微环境的性质b.载体性质的影响载体性质的影响带负电载体：最适带负电载体：最适 pH 带正电载体：最适带正电载体：最适 pH c.产物性质的影响产物性质的影响酸性产物：最适酸性产物：最适 pH 碱性产物：碱性产物：最适最适 pH 4.44.4 应用实例应用实例Exam

37、ples：甜味剂工业甜味剂工业-D-吡喃葡萄糖吡喃葡萄糖葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶-D-呋喃果糖呋喃果糖固定化葡萄糖异构酶：固定化葡萄糖异构酶：年产量年产量12-20t（干重），半衰期（干重），半衰期 80150天，反应天，反应温度温度 5860固定化方法：固定化方法：1.细胞交联法（细胞交联法（Novo公司）公司）2.结晶与离子交换吸附法（结晶与离子交换吸附法（Genencor公司）公司）固定化固定化-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：半衰期半衰期 20个月，生产能力个月，生产能力2000kg产物产物/kg催化剂催化剂乳糖乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖半乳糖 固定化方法：固定化方法：基于基于Euper

38、git载体载体使用固定化酶的公司：使用固定化酶的公司：Corning，Valio，Suminoto，Snam Progetti葡萄糖葡萄糖+固定化固定化-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：处理处理300t含含15%棉子糖的糖蜜棉子糖的糖蜜/d，1990棉子糖棉子糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖半乳糖固定化方法：固定化方法：酶与微生物酶与微生物Mortierella vinacea菌丝体交联菌丝体交联使用固定化酶的公司：使用固定化酶的公司：Hokkaido Sugar蔗糖蔗糖+蔗糖蔗糖蔗糖异构酶蔗糖异构酶1-O-D-吡喃葡萄吡喃葡萄糖基糖基-D-呋喃果糖呋喃果糖异麦芽酮糖异麦芽酮糖+明串珠菌二糖明串珠菌二糖

39、+固定化固定化蔗糖异构蔗糖异构酶：酶：半衰期半衰期8000h以上，生产以上，生产60000t异麦芽酮糖异麦芽酮糖/a，1987固定化方法：海藻酸钠交联包埋法固定化方法：海藻酸钠交联包埋法使用固定化酶的公司：使用固定化酶的公司：Sudzucker AG，Cerestar，Mitsui Seito Co.低低聚聚糖糖Examples：抗生素工业抗生素工业固定化酶固定化酶 1t氨气氨气 45t水水 10000m3约约30二甲基氯硅烷二甲基氯硅烷 300tN,N-二甲基苯胺二甲基苯胺 800t五代氯磷酸五代氯磷酸 600t氨气氨气160t二氯甲烷二氯甲烷 4200m3n-丁醇丁醇 4200m3-40青

40、霉素青霉素G，1000t6-APA，500t固定化青霉素酰化酶水解青霉素固定化青霉素酰化酶水解青霉素6-APA:6-氨基青霉素烷酸生产商生产商Asahi Chem.Ind.DSMRecordati酶来源酶来源巨型芽孢杆菌巨型芽孢杆菌类产碱杆菌类产碱杆菌大肠杆菌大肠杆菌固定化方法固定化方法共价法，共价法，多孔聚丙烯腈多孔聚丙烯腈共价法，共价法，凝胶载体凝胶载体共价法，共价法，Eupergit载体载体固定化收率固定化收率未知未知未知未知60-70%酶活力酶活力未知未知约约200U/mL100-150U/mL,湿载体湿载体温度温度30-36未知未知37操作稳定性操作稳定性约约1000h未知未知高达高达1000循环，循环，60d青霉素青霉素G水解的反应条件水解的反应条件Examples：氨基酸生产氨基酸生产N-酰基酰基-DL-氨基酸氨基酸酰基转移酶酰基转移酶L-氨基酸氨基酸N-酰基酰基-D-氨基酸氨基酸+水水+酰基转移酶通过吸附剂固定在离子交换树脂上酰基转移酶通过吸附剂固定在离子交换树脂上