酶工程酶的生产和纯化课件.pptx

1、酶工程酶的生产和纯化（优选）酶工程酶的生产和纯化2022-11-172合适的酶源？一级生物？足够酶产量？细胞是否稳定？易于后处理？成本高低？纯化能否成功？筛选新酶源有机体中转入新基因传统/基因技术提高产量改进发酵条件改进后处理：减少费用和浪费；提高纯度更具竞争力、更廉价的目标酶Contents of chapter 22.22.2 酶的生产及提高酶产量的措施酶的生产及提高酶产量的措施2.32.3 酶的下游处理酶的下游处理GoGoGo2.12.1 酶源酶源2.12.1 酶源酶源动植物组织动植物组织动植物细胞动植物细胞野生微生物野生微生物重组微生物重组微生物Enzyme source12%88%-

2、淀粉酶淀粉酶(曲霉曲霉)葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶(曲霉，根霉曲霉，根霉)果胶酶果胶酶/果胶裂合酶果胶裂合酶(曲霉曲霉)乳糖酶乳糖酶(曲霉，克鲁维酵母曲霉，克鲁维酵母)蔗糖酶蔗糖酶/葡聚糖酶葡聚糖酶(酵母酵母)微生物凝乳酶微生物凝乳酶(毛霉毛霉)葡聚糖酶葡聚糖酶(青霉青霉)/-淀粉酶淀粉酶(芽孢杆菌芽孢杆菌)青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶(芽孢杆菌芽孢杆菌)支链淀粉酶支链淀粉酶(克雷伯菌克雷伯菌/芽孢杆菌芽孢杆菌)木糖异构酶木糖异构酶(芽孢杆菌芽孢杆菌/链霉菌链霉菌)天冬酰胺酶天冬酰胺酶(大肠杆菌大肠杆菌)DNADNA连接酶连接酶(大肠杆菌大肠杆菌)过氧化氢酶过氧化氢酶(肝脏肝脏)胰蛋白酶胰蛋白酶(胰

3、脏胰脏)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(胰脏胰脏)三脂酰甘油脂肪酶三脂酰甘油脂肪酶(胰脏胰脏)凝乳酶（胃）凝乳酶（胃）猕猴桃蛋白酶猕猴桃蛋白酶/-淀粉酶淀粉酶(麦芽麦芽)脂肪加氧酶脂肪加氧酶(大豆大豆)-葡聚糖酶葡聚糖酶(麦芽麦芽)无花果蛋白酶无花果蛋白酶工业酶生产所用的原料工业酶生产所用的原料细菌细菌真菌真菌植物植物动物动物微生物产酶微生物产酶之优点之优点 微生物种类繁多产酶种类齐全生长周期短繁殖快不受季节气候限制培养基来源丰富产酶成本低易变异，用遗传技术培育高产理想菌株培养简便易行易管理、工厂化生产安全无毒，非致病菌安全无毒，非致病菌周期短，产量高周期短，产量高遗传性能稳定，不易退化遗传性能稳定

4、，不易退化易于酶分离纯化易于酶分离纯化易培养，廉价易得易培养，廉价易得新产酶菌种需毒理和动物实验，食品和医药酶需经有关部门批准。新产酶菌种需毒理和动物实验，食品和医药酶需经有关部门批准。n一般产胞内酶n主要的酶品种q谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等q基因工程操作酶：限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）n能产生多种胞外酶n主要酶品种q淀粉酶类：如-淀粉酶（胞外）q蛋白酶类：如中性蛋白酶（胞外）q磷酸酶类：碱性磷酸酶（细胞间质）、5-核苷酸酶等枯草杆菌（枯草杆菌（B.subtilis）链霉菌（链霉菌（Streptomyces）n主要酶品种q葡萄糖异构

5、酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶、碱性/中性蛋白酶等q含有丰富的16-羟化酶，用于甾体转化黑曲霉（黑曲霉（Aspergillus niger）n可生产多种酶（胞内酶或胞外酶）n主要酶品种q糖化酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶等n广泛应用于酿造和食品行业n主要酶品种q糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶等米曲霉（米曲霉（Aspergillus oryzae）n菌落成熟后产红色色素，颜色较深n腐生真菌，能耐受pH 3.5和10%酒精，尤嗜乳酸n主要酶品种q-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、麦芽糖酶、酯酶等红曲霉属（红曲霉属（Monas

6、cus）n腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面n主要菌种和酶的种类q产黄青霉（Penicillium chrysogenum）q葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等q橘青霉（Penicillium citrinum）q脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5-磷酸二酯酶、核酸酶等青霉属（青霉属（Penicillium）青霉属（青霉属（Penicillium）n主要酶种类q纤维素酶q亦用于生产17-羟化酶，用于甾体转化木霉（木霉（Trichoderma）绿色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的显微形态n主要产酶品种q糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素

7、酶等q具有11-羟化酶，用于甾体药物转化根霉（根霉（Rhizopus）n能糖化淀粉，能分解大豆蛋白，多用来做豆腐乳、豆豉n主要产酶品种q蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等毛霉（毛霉（Mucor）n广泛应用于食品工业，细胞呈圆形、卵形、椭圆形，在麦芽汁培养基上菌落白色有光泽n主要产酶品种q醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转化酶等啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）n细胞呈圆形、卵形或长形，出芽成假菌丝，在麦芽汁琼脂培养基上菌落乳白色或奶油色n主要产酶品种q脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶、17-羟化酶、具烷类代谢的酶系等假丝酵母属（假丝酵母属（Candi

8、da）美国食品加工酶及菌种数目美国食品加工酶及菌种数目中国食品加工酶及菌种数目中国食品加工酶及菌种数目How to Screen New Enzymes？采样采样产酶菌种筛选产酶菌种筛选产酶菌种改良产酶菌种改良富集培养，菌种分离富集培养，菌种分离 为获得降解某种物质的产酶菌种，通常在该物质较丰富的地方寻找。a.采样采样木质素酶木质素酶or纤维素酶纤维素酶 尿酸酶尿酸酶污染物降解酶污染物降解酶 嗜热酶嗜热酶thermophilic enzyme 嗜冷酶嗜冷酶psychrophilic enzyme 嗜酸嗜酸/嗜碱酶嗜碱酶acidphilic/alkaliphilic enzyme 嗜盐酶嗜盐酶h

9、alophilic enzyme 极端酶极端酶b.产酶菌种筛选产酶菌种筛选 对分离出的菌种做产酶能力检测，选出理想产酶菌株，包括初筛和复筛两个阶段。初筛：挑出产目的酶的菌株，方法快速、简便，多采用 平板培养透明圈法。复筛：筛选产酶量高、性能更符合要求的菌株，方法更 准确，培养方式更符合工业生产，摇瓶/固体培养。以淀粉为碳源，在含KI-I2的淀粉培养基上，菌落周围因分泌出的-淀粉酶将淀粉水解而导致蓝色消失，生成“水解圈”。例：例：-淀粉酶生产菌的筛选淀粉酶生产菌的筛选在培养基中添加酪蛋白，经蛋白酶的水解，培养基相应位置变为澄清的“水解圈”。例：例：蛋白酶蛋白酶生产菌的筛选生产菌的筛选c.产酶菌种

10、改良产酶菌种改良 原菌株原菌株细胞或孢子悬浮液制备细胞或孢子悬浮液制备诱变剂处理诱变剂处理中间培养中间培养初筛初筛复筛复筛突变株分离突变株分离生产性实验生产性实验诱变育种诱变育种目的基因获取目的基因获取基因表达载体构建基因表达载体构建目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定基因工程育种基因工程育种23145案例：纤维素酶高产菌案例：纤维素酶高产菌出发菌株选择出发菌株选择菌悬液的制备菌悬液的制备斜面培养基30 2-4d;斜面孢子摇瓶振20min;过滤稀释至105-107个/mL菌悬液出发菌株黑曲霉LH24纤维素酶活力平均12030 U/g紫外线诱变处理紫外线诱

11、变处理5mL菌悬液紫外灯30W距30cm,照射1min，打开培养皿照射5min，暗冷藏1-2h诱变菌液于培养基平板,筛出生长良好菌株发酵,得9株高产株,产酶量14000 U/g初筛初筛复筛复筛初筛菌株接种到培养液,3h后测酶活复筛，得3株产酶量16000 U/g 4案例：高产案例：高产N-乙酰神经氨酸裂合酶的乙酰神经氨酸裂合酶的12345按nanA基因设计合成引物;PCR扩增nanA基因酶切PCR产物和质粒;连接转化培养;凝胶电泳重组质粒构建重组质粒构建PCRPCR扩增基因扩增基因基因诱导表达基因诱导表达将阳性克隆培养;接种于LB培养基;诱导表达离心收集菌体;取上清SDS PAGE电泳;酶表达

12、量凝胶电泳分析凝胶电泳分析 NPLNPL活力测定活力测定酶促反应;580nm测吸光度;工程菌酶活提高d.富集培养，菌种分离富集培养，菌种分离 菌种分离：自然条件下各类微生物混杂，须分离获得纯种。通常采用平板划线法和反复稀释法。富集培养：通常样品中所需菌很少，需使所需菌大量生长，不需菌少或不生长，以利于筛选。可控制温度、pH，或用底物作营养成分，使所需菌快速生长。2.22.2 酶的生产及提高酶产量的措施酶的生产及提高酶产量的措施HOW ARE INDUSTRIAL ENZYMES MADE？SeedfermenterAirpetri dish flask Food&NutrientsCell R

13、omoval Cells toCompostingConcentrationPurificaitonModificationpreservativesBlendingDrying HeatLiquids PowdersShip to customersAirLargefermenterRefinningProductionDownstream案例：枯草杆菌案例：枯草杆菌产纳豆激酶产纳豆激酶菌种斜面摇瓶培养种子罐发酵罐发酵液低温离心超滤浓缩低温沉淀离心真空抽干粉碎成品碳碳 源源：麦芽糖,木糖,蔗糖(1.5-4%)或麦芽汁+酵母膏(0.1-2%)氮氮 源源：大豆蛋白胨、豆饼粉(2-5%质量比)或豆

14、浆无机盐无机盐：KH2PO4(0.1%),K2HPO4(0.3%),MgSO4(0.05%),CaCl2(0.02%)发酵罐发酵罐：通气量/min 1:0.51:1(V/V),搅拌200-400r/min，罐 温36.5-37.5,罐压0.03-0.05MpaWhat Factors Affect Enzyme Production？Culture mediumpHTemperatureDissolved O2 etc.Fermentation process Biosynthesis process 2.2.1 酶生物合成的调节酶生物合成的调节DNA RNA Protein Active E

15、nzyme转录逆转录复制翻译？折叠蛋白质的生物合成翻译中的生物调节RNA的生物合成 转录中的生物调节（基因调节）ua.大肠杆菌生产半乳糖苷酶，-半乳糖苷酶，硫代半乳糖苷转乙酰酶 E.Coli grwon in glucose medium，E.Coli grwon in lactose medium，u b.大肠杆菌生产色氨酸合成酶 E.Coli grwon in glucose medium，E.Coli grwon in glucose medium adding tryptophan，u c.大肠杆菌生长 E.Coli grwon in glucose and lactose mediu

16、m“biphasic growth”葡萄糖耗尽后才利用乳糖，两个对数生长期葡萄糖耗尽后才利用乳糖，两个对数生长期02468020406080 细胞 浓 度(OD)时 间(h)调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性）基基 因因 表表达达mRNAa.a.酶的诱导：乳糖操纵子酶的诱导：乳糖操纵子乳糖酶的诱导乳糖酶

17、的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）-Galactosidase，permease，acetylase调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，代谢产物与阻遏蛋白结合，使构象变化，与操纵基因结使构象变化，与操纵基因结合，结构基因不能表达合，结构基因不能表达b.b.酶的反馈阻遏：色氨酸操纵子酶的反馈阻遏：色氨酸操纵子c.c.酶的分解代谢物阻遏酶的分解代谢物阻遏RLacZLa

18、cYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPcAMP：环腺苷酸；：环腺苷酸；CAP：环腺苷：环腺苷酸受体蛋白或降解物基因活化蛋白酸受体蛋白或降解物基因活化蛋白降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏

19、蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂调控方式调控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 与操纵基与操纵基因结合因结合阻遏效应阻遏效应举例举例酶的诱导酶的诱导有活性有活性不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译诱导物诱导物转录，转录，继而翻译继而翻译乳糖操乳糖操纵子纵子酶的阻遏酶的阻遏无活性无活性阻遏物阻遏物不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译色氨酸色氨酸操纵子操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3 水解水解4 蛋白质水解蛋白质水解2阻遏阻遏 作用作用1 Add

20、 inducer2 Control repression3 Reduce mRNA hydrolysis1诱导诱导 活化活化5 形成包含体形成包含体6 缺少辅因子缺少辅因子4 Reduce proteases or increase chaperon5 Reduce protein synthesis by T6 Increase cofactor synthesis2.2.2 酶发酵过程的控制酶发酵过程的控制 2.2.2.3.发酵条件对产酶的影响2.2.2.2.发酵产酶动力学2.2.2.1.酶生物合成的模式GoGoGo2.2.2.1.酶生物合成的模式酶生物合成的模式0TimeABCDCell

21、amount微生物细胞生长曲线（四阶段）0-A 调整期（延迟期）调整期（延迟期）A-B 生长期（对数生长期）生长期（对数生长期）B-C 平衡期平衡期C-D 衰退期衰退期总细胞浓度活细胞浓度时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型 根据酶产生与细胞生长的关系细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n酶的生物合成与细胞生长同步进行（生长偶联型）n大部分组成酶和部分诱导酶属于此类。n酶对应的 mRNA 很不稳定时间细胞/酶浓度A.A.同步合成型同步合成型组成酶组成酶：细胞中一直存在的酶，其合成仅受遗传物质控制。在细胞中的量比较恒定，环境因素影响不大

22、。诱导酶诱导酶：在环境中有诱导物存在时而产生的酶，其合成取决于基因控制和环境影响。在细胞中含量变化很大。细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n例：米曲霉在含有单宁或没食子酸的培养基中生产单宁酶 tanase EC 3.1.1.20细胞浓度细胞浓度mg/ml酶浓度酶浓度U/ml总细胞浓度总细胞浓度 活细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度胞内酶浓度n酶合成随细胞生长而开始，细胞进入平衡期后，酶能延续合成一段时间。n属此类的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。n酶所对应的 mRNA 稳定性好。时间细胞/酶浓度B.B.延续合成型延续合成型细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n例：黑曲霉在以半乳糖醛酸或纯果胶

23、为单一碳源的培养基中，诱导产生聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）细胞浓度细胞浓度mg/ml酶浓度酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物以半乳糖醛酸为诱导物 细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n酶合成在细胞生长一段时间后才开始，细胞进入平衡期后酶的合成随之停止n酶合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏作用n酶所对应的 mRNA 稳定性较差时间细胞/酶浓度C.C.中期合成型中期合成型细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n例：枯草杆菌碱性磷酸酶 EC 3.1.3.1 受其水解产物磷酸的反馈阻遏作用细胞浓度细胞浓度mg/ml酶浓度酶浓度U/ml细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n当细胞生

24、长一段时间或进入平衡期后，才开始合成并大量积累酶。n许多水解酶属于此类。n阻遏物延缓了酶的合成。n此类酶 mRNA 稳定性好。时间细胞/酶浓度D.D.滞后合成型滞后合成型细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度n例：黑曲霉生产羧基蛋白酶 EC 3.4.23.6细胞细胞浓度浓度mg/ml酶酶浓度浓度U/ml细胞浓度细胞浓度酶浓度酶浓度酶的生物合成模式总结酶的生物合成模式总结n关键因素q酶对应的 mRNA 稳定性q培养基中是否存在阻遏物n延续合成型是最理想的合成模式n通过基因工程、代谢工程、细胞工程等手段，筛选优良菌株，使合成模式接近延续合成型qmRNA 稳定性q阻遏物2.2.2.2.发酵产酶动力学发酵产酶动

25、力学 n产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。q宏观产酶动力学：从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率q微观产酶动力学：从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率宏观产酶动力学表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。XdtdE式中式中 X X细胞浓度细胞浓度(g/L)(g/L)细胞比生长速率细胞比生长速率(h(h-1-1)生长偶联的比产酶系数生长偶联的比产酶系数(IU/g)(IU/g)非生长偶联的比产酶速率非生长偶联的比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h)E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L)t t时间时间(h)(h)产酶动力学方程：

26、产酶动力学方程：生长偶联型（同步/中期合成型）XdtdE部分生长偶联型(滞后合成型)XXdtdE非生长偶联型(延续合成型)XdtdE2.2.2.3.发酵条件对产酶的影响发酵条件对产酶的影响nA.细胞活化与扩大培养nB.培养基nC.pH值nD.温度nE.溶解氧A.A.细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养n菌种保藏：短期保藏、长期保藏n菌种活化：使用前接种于新鲜培养基上，培养以恢复细胞生命活动能力n扩大培养：q为保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化细胞要经一级至数级扩大培养q一般培养到细胞处于对数生长期为宜q采用孢子接种，则应培养至孢子成熟期n培养基的组成q碳源、氮源、水、无机盐、生长因子n根据微

27、生物种类和生长条件确定培养基，同种细胞用于不同的酶生产，培养基成分不一样n生长、增殖、发酵、产酶等各阶段所需有区别n种子培养基和发酵培养基不一样n尽量减少培养基中对产酶的阻遏作用的物质B.B.培养基的影响培养基的影响npH值对发酵产酶的影响q影响酶解离、电荷分布、构象和酶活、膜通透性、底物和产物的性质q改变酶之间的产量比例n产酶最适pH值：通常接近酶反应最适pH值，但一般不同于细胞生长的最适pH值npH的变化：随细胞生长培养基pH会发生变化npH的调控：培养基组分、比例、缓冲液、酸碱、补料C.pHC.pH值的调节和控制值的调节和控制n产酶温度 产酶温度往往低于生长温度q较低温度mRNA 稳定性

28、较高，延续酶的合成q温度过低微生物代谢减慢，延长发酵周期n温度的变化 因细胞新陈代谢和热量扩散，温度不断变化n温度的调节q热水升温q冷水降温D.D.温度的调节和控制温度的调节和控制qK KO2O2 耗氧速率耗氧速率，指单位时间内单位体积培养液中细胞的耗氧量，(mmol O2)h-L-1qQO2 细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量，(mmol O2)h-1(g DC)-1qCcell 细胞浓度，单位体积培养液中细胞质量，(g DC)L-1E.E.溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制22OOcell=KQCq K Kd d 溶氧速率溶氧速率（溶氧系数），单位体积发酵液在单位时间溶解氧的量，

29、(mmol O2)h-1L-1当 Kd=KO2 时，培养液中溶氧量保持恒定n溶氧量的调节方法溶氧量的调节方法q通气量：增大通气量提高KdqO2 分压：提高O2 分压，可增加O2 溶解度，提高Kdq气液接触时间：延长接触时间，可增加O2 溶解量q气液接触面积：增大接触面积能提高Kdq培养液黏度：黏度大易产生泡沫，影响O2溶解How to Improve Enzyme Output？2.2.3.1.添加诱导物添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。

30、诱导物一般可以分为诱导物一般可以分为3 3类类 酶的作用底物 酶的催化反应产物 作用底物的类似物2.2.3 提高酶产量的措施提高酶产量的措施 2.2.3.2.控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏产物阻遏和分解代谢物分解代谢物阻遏阻遏两种。a.a.产物阻遏作用产物阻遏作用是是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。b.b.分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基

31、中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。2.2.3.3.添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。5

32、Reduce protein synthesis by T蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等葡萄糖淀粉酶(曲霉，根霉)viride)的菌落harzianum)的显微形态微生物细胞生长曲线（四阶段）thermophilic enzyme天冬酰胺酶(大肠杆菌)酶合成随细胞生长而开始，细胞进入平衡期后，酶能延续合成一段时间。t时间(h)halophilic enzyme较低温度mRNA 稳定性较高，延续酶的合成2.2.3.4.添加产酶促进剂添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高

33、120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。2.32.3 酶的下游处理酶的下游处理Downstream of Enzyme production离心或微滤法分离细胞离心或微滤法分离细胞纳滤法浓缩细胞内周质和胞外酶纳滤法浓缩细胞内周质和胞外酶渗透法或酶法渗透法或酶法破除细胞壁破除细胞壁离心或超滤法提纯离心或超滤法提纯色谱纯化色谱纯化培养基培养基细胞外酶细胞外酶周质酶周质酶细胞内酶细胞内酶细胞黏浆细胞黏浆酶法酶法/机械法去除机械法去除细胞壁和细胞膜细胞壁和细胞膜