基因工程菌生长代谢的特点课件.ppt

1、第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示。菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源控工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。有重要意义。1一、菌体的生长与能量的关系一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长碳源物

2、质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的菌体会产生乙酸，导致培养基的pHpH值下降，值下降，从而影响菌体的生长。适当提高从而影响菌体的生长。适当提高pHpH，可减少，可减少乙酸的抑制作用乙酸的抑制作用2 分批培养中选择不同的碳源，连续分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产

3、生。乙酸的产生。3 大肠杆菌中克隆携带氧能力的大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHBVHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。蛋白的基因可提高菌体生长速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。4二、菌体生长与前体供应的关系二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程胞竞争共同的前体和催化结构

4、，致工程菌生长速率降低。菌生长速率降低。5 质粒存在对菌体代谢的影响：中等质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（拷贝质粒（5656拷贝）的工程菌中与前体合拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（高拷贝质粒的工程菌（240240拷贝）中，拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生而产生“严紧反应严紧反应”有关。有关。6 “严紧反应严紧反应”是当氨酰是当氨酰tRNAtRNA

5、不足时不足时,核核糖体在密码子上停留糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点并合成被称为魔点的的ppGppppGpp的结果。的结果。ppGppppGpp是一个重要的调控分子。它通是一个重要的调控分子。它通过影响过影响RNARNA链的延深过程减少转录。链的延深过程减少转录。7 它的浓度增加会导致在合成它的浓度增加会导致在合成mRNAmRNA和和rRNArRNA时时RNARNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNARNA链延长速度减慢，使游离的链延长速度减慢，使游离的RNARNA聚合酶浓度降聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如低，严紧控制的启动子如rrnArrnA等的转录减少

6、。等的转录减少。也可能也可能ppGppppGpp是通过干扰是通过干扰RNARNA聚合酶与聚合酶与PLPL启动子专一识别反应。启动子专一识别反应。8第六节第六节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。不稳定的现象。质粒不稳定可分为：质粒不稳定可分为：分裂不稳定分裂不稳定 结构不稳定结构不稳定9分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定定 比例不含质粒子代菌的现象。比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的

7、改变碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变10一、质粒不稳定产生的原因一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素：常见分裂不稳定的两个因素：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差异的大小。这两种菌比数率差异的大小。11 对同一工程菌控制不同的比生长数率对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但

8、对稳定性不利。菌频率低但对稳定性不利。12质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素 平平 板板 培培 养基养基10-12h10-12h100100个菌落个菌落含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素平平 板板 培培 养养 基基 10-12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次,计算比值计算比值 (稳定性稳定性stability)stability)13二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：两阶段培养法：先使菌体生长至一定密度；先使菌体生长至一定密

9、度；再诱导外源基因的表达再诱导外源基因的表达14 由于第一阶段外源基因未表达，减小由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。增加了质粒稳定性。在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。菌的生长，提高质粒稳定性。调控环境参数如温度、调控环境参数如温度、pHpH、培养基组、培养基组分和溶解氧浓度分和溶解氧浓度15 有些含质粒菌对发酵环境的改变有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善

10、质件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。率，都可以提高质粒稳定性。16 大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。大分子的和成和菌体的生长。17第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试基因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生基

11、因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法的选择，分离精制技术的选择。提取方法的选择，分离精制技术的选择。18一一 工程菌选择工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一般用于中试的工程菌需具备的条件试能用一般基因重组技术获得，有高产潜力，能有工基因重组技术获得，有高产潜力，能有工业原料

12、薇培养基，生产工期能采用一般工业原料薇培养基，生产工期能采用一般工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不致业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不致病，无毒性，能安全生产，符合国家卫生病，无毒性，能安全生产，符合国家卫生部门有关规定，产品有特异性，发酵液粘部门有关规定，产品有特异性，发酵液粘度小。度小。19二二 反应器设计反应器设计三三 发酵培养基组成发酵培养基组成培养基组成及作用：培养基组成及作用：提供化学元素提供化学元素提供特殊营养源提供特殊营养源提供能源提供能源控制代谢控制代谢20四四 工艺最佳化与参数监测控制工艺最佳化与参数监测控制1.1.工艺最佳化工艺最佳化 是指最快周期，最高产量，最好质量，

13、最低消耗，是指最快周期，最高产量，最好质量，最低消耗，最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化速最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化速度与最低失败率等的综合指标度与最低失败率等的综合指标2.2.参数监测控制参数监测控制 需监测与控制的需监测与控制的4 4种参数：种参数：A A，主要参数：，主要参数：pH,pH,温温度，溶氧。度，溶氧。B B，生物量：浑浊度，细胞组分，总氮，生物量：浑浊度，细胞组分，总氮量及菌丝干重。量及菌丝干重。C C，碳源：糖，有机酸，淀粉。，碳源：糖，有机酸，淀粉。D D，产品。产品。21五 计算机的应用22第八节 重组工程菌的培养 基因工程菌的培养过程包括:通过摇瓶

14、操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。23菌种菌种 一级种子摇瓶一级种子摇瓶 二级种子罐培养二级种子罐培养 扩大培养扩大培养 原料原料 发酵培养发酵培养 灭菌灭菌 发酵生产发酵生产 代谢产物分离代谢产物分离 基配制基配制 微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图24 一 基因工程菌的培养方式1.分批培养2.补料分批培养3.连续培养4.透析培养5.固定化培养25 2.2.补料分批培养补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养反应器中

15、进行培养,经过一段时间后间经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。进一步生长的方法。26二、基因工程菌的培养工艺二、基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同物发酵不同,基因工程菌带外源基因基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。间的相互关系还和环境有关。27 工艺要求：外源基因既高效表达，工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影又有利于产品

16、分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：响较大的几个因素有：1.培养基的影响2.接种量的影响3.温度的影响4.溶氧量的影响5.诱导时机的影响6.诱导表达程序的影响7.pH的影响28 培养基的影响培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。物、玉

17、米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。还有无机盐、维生素等。29 不同的碳源对菌体的生长和外源基不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对对laclac启动子有阻遏作用。乳糖对启动子有阻遏作用。乳糖对laclac启启动子有利动子有利。30 在氮源中，酪蛋白水解物有利在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对于产

18、物的合成与分泌。色氨酸对trptrp启动子控制的基因有影响。启动子控制的基因有影响。无机磷在许多代谢反应中是一无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。菌体生长。31接种量的影响接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。积的比例。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。不利于外源基因表达。32 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速

19、繁衍，很快进入对数生长期，适迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长的生长。33 温度的影响温度的影响 温毒对基因表达的调控作用发生在温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。等水平上。温度对发酵过程的影响是多方面的。温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。谢产物的反应方向，影响代谢

20、调控机制。34 适宜的发酵温度是既适合菌体的生适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和包含体温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。的形成。35 溶解氧的影响溶解氧的影响 对于好氧发酵对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的溶解氧浓度是重要的参数。参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。则能提高

21、发酵产率。36 发酵时，随发酵时，随DODO2 2浓度的下降，细胞生长减浓度的下降，细胞生长减慢，慢，STST值下降，发酵后期下降幅度更大。值下降，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的维持较高的DODO2 2值，才能提高工程菌的生值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。程中的氧供给，提高活菌产量。37 诱导时机的影响诱导时机的

22、影响 对于对于PP启动子型的工程菌，使用启动子型的工程菌，使用cIcI阻阻遏蛋白的温度敏感型突变株（遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857clts857），在），在282830 30 0 0C C下培养时，该突变体能合成有活性下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏的阻遏蛋白阻遏PLPL启动子的转录；启动子的转录；当温度升高当温度升高42 42 0 0C C时，该阻遏蛋白失活，时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。诱导表达。38 在对数生长期，细

23、胞快速繁殖，直在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到到细胞密度达到10109 9/个为止，这时个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，急增，营养和氧营养和氧成了菌群旺盛代谢成了菌群旺盛代谢的限制因素。的限制因素。397 pH7 pH的影响的影响 pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对据工程菌的生长和代谢情况，对pHpH进行适当的调节。进行适当的调节。40 如采取两段培养工艺，培养前期如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，重点是

24、优化工程菌的生长条件，其最佳其最佳pHpH在在6.86.87.47.4左右左右;培养培养后期重点是优化外源蛋白的表达后期重点是优化外源蛋白的表达条件条件,其最佳其最佳pHpH为为6.06.06.56.5。41 总之总之,最佳化的工艺是获得最佳化的工艺是获得:最快周期、最高产量、最好质最快周期、最高产量、最好质 量、量、最低消耗、最大安全性、最周全的最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。败率等。42三、基因工程菌的培养设备三、基因工程菌的培养设备 应用发酵罐大规模培养基因工程菌。应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物

25、发酵目它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产发酵是为了获得最大量的基因表达产物。物。43 发酵罐的组成有：发酵罐的组成有：发酵罐体、保证高传质作用的搅发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。统、培养液配制和连续操作系统。44 对发酵罐要求：对发酵罐要求：提供菌

26、体生长最适生长条件，提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，培养过程不得污染，保证纯菌培养，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等不能干扰细菌代谢活动等。4546第九节 高密度发酵 利用大肠杆菌表达重组基因产物与传统发酵培养不同，重组菌培养有自身的特点，即目的基因克隆自啊质粒上，存在分裂不稳定性和结构不稳定性；随着培养环境的改变，质粒拷贝数会有增有减，基因剂量也会相应变化；大多数克隆基因的表达是已知启动子控制的，因而易通过改变环境条件来调节。47v高密度发酵是一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最

27、高值可达200gDCW/L48一 影响高密度发酵的因素v1.培养基v2.溶氧浓度v3.pHv4.温度v5.代谢副产物49二二 实现高密度发酵的方法实现高密度发酵的方法v1.1.发酵条件的改进发酵条件的改进（1 1）培养基的选择）培养基的选择（2 2）建立流加式培养的方式）建立流加式培养的方式（3 3）提高供氧能力）提高供氧能力v2.2.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌（1 1）阻断乙酸产生的主要途径）阻断乙酸产生的主要途径（2 2）对碳代谢流进行分流）对碳代谢流进行分流（3 3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流）限制进入糖酵解途径的碳代谢流（4 4）引入血红蛋白基因

28、）引入血红蛋白基因v3.3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌50第十节第十节 基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的分离、纯化非常基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白重要。表达的产物都是多肽或蛋白质质 。它的制得具有以下特点：。它的制得具有以下特点：表达产物在初始料中含量较低；表达产物在初始料中含量较低；51含有大量细胞及代谢产物；含有大量细胞及代谢产物；表达产物稳定性差，易失活变表达产物稳定性差，易失活变性；性；表达产物的种类繁多、结构不表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；一、活性各异；对其质量要求纯度高、无

29、菌、对其质量要求纯度高、无菌、无热原。无热原。52一、建立分离纯化工艺的根据一、建立分离纯化工艺的根据 含目的产物的起始料的特点含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：括：菌种的类型及其代谢特性。菌种的类型及其代谢特性。原材料培养基的来源及其质量。原材料培养基的来源及其质量。生产工艺及条件。生产工艺及条件。53 物料中杂质的种类和性质。物料中杂质的种类和性质。目的产物特性。目的产物特性。产品质量的要求产品质量的要求54二二 、分离纯化的基本过程、分离纯化的基本过程 发酵液发

30、酵液 细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物 胞外产物胞外产物 细胞破碎细胞破碎 固液分离固液分离 浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品包含体包含体 细胞碎片分离细胞碎片分离 变性变性 复性复性55三、分离纯化的技术三、分离纯化的技术分离纯化的技术要求：分离纯化的技术要求：技术条件温和能保持产物生物技术条件温和能保持产物生物活性。活性。选择性好，能从复杂的混合物选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。到较高的纯化倍数。56收率要高。收率要高。两个技数间能直接衔接，两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。不需要对物

31、料加以处理。纯化过程要快，满足高纯化过程要快，满足高 生产率的要求。生产率的要求。57细胞破碎与固液分离细胞破碎与固液分离 细胞收集：细胞收集：离心法、膜分离法。离心法、膜分离法。细胞破碎：机械破碎法、非机细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。械破碎法。固液分离固液分离58目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。生物学特性来决定。产产 物物 特特 性性 作作 用用 等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种

32、类及条件相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间59目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特据其分子的理化性质和生物学特性来决定。性来决定。60 产产 物物 特特 性性 作作 用用 等电点等电

33、点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间 产物的特性在分离纯化中的作用产物的特性在分离纯化中的作用61分离纯化的方法依赖色谱分离方法分离纯化的方法依赖色谱分离方法 离子交换层析（离子交换层析（ion exchange ion exchange chromatography IECchromatog

34、raphy IEC）离子交换层析的基本原理是通过带电离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。要方法。62反相色谱反相色谱（reversed phase chromatographyreversed phase chromatography，RPCRPC）和和 疏水色谱疏水色谱（hydrophobic interaction chrom

35、atographyhydrophobic interaction chromatography，HICHIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。作用力的大小差异进行分离的。63 常用固定相为硅胶烷基键合相。常用固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强

36、度的酸性水溶液，流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。64 疏水色谱的原理与反相色谱的原理疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色固定相介质表面的疏水性比

37、反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为流动相为pH6pH68 8盐水溶液。盐水溶液。65 在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收率与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性

38、小。较高，蛋白质变性可能性小。66亲和层析（亲和层析（affinity affinity chromatographychromatography，ACAC）亲和层析是利用固定化配基与目亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用与激素、酶与底物之间的作用。67 配基：在亲和层析中起可逆性结合的配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：亲和层析大体可分三步：配基固定化配基固定化吸附目的物

39、吸附目的物样品解吸样品解吸68凝胶过滤凝胶过滤 凝胶过滤是以具有大小一定的多孔凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子这种移动差别可使大分子与小分子分开。分开。69 根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：主要应用两个方面：脱盐和更换

40、缓冲液脱盐和更换缓冲液 蛋白质分子的分级分离。蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。多聚体及降解产物。70非蛋白质杂质的去除非蛋白质杂质的去除 DNA DNA、热原质和病毒的纯化方法：、热原质和病毒的纯化方法：DNADNA的去除的去除 DNADNA在在pH4.0pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的以上呈阴离子，蛋白质的pIpI在在6.06.0以以上上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNADNA不吸附。

41、亲和层不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。析和疏水层析也有效。热原质的去除热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。糖是疏水性可用疏水层析法。病毒的去除病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。层析或过滤可将病毒去除。71非蛋白质杂质的去除非蛋白质杂质的去除 DNA DNA、热原质和病毒的纯化方法：、热原质和病毒的纯化方法：

42、DNADNA的去除的去除 DNADNA在在pH4.0pH4.0以上呈阴离以上呈阴离子，蛋白质的子，蛋白质的pIpI在在6.06.0以上以上,可用阴离子可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而而DNADNA不吸附。亲和层析和疏水层析也不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。有效。72热原质的去除热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂

43、多糖是阴离子可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。水性可用疏水层析法。病毒的去除病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。层析或过滤可将病毒去除。73四、选择分离纯化方法的依据四、选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液体积很分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。沉淀和超滤法。74 产物在周质表达是介于细胞内可溶性产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式表达和分泌表达的一种形式,它可以它可以

44、避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质类杂质,在一定程度上有利于在一定程度上有利于分离纯分离纯化化.为了获得周质蛋白为了获得周质蛋白 经低浓度溶菌酶处理后经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透可采用渗透压休克的方法来获得。压休克的方法来获得。75 可溶性表达产物破菌后的细胞可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。子交换层析。76根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择 应选择不同机制的分离单元组成一套应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。分离工艺，尽早采用高效的分离手段。先将

45、最多的杂质去除，将费用最高、先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。77 随后采用高分辨率的操作单元随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离过滤放在最后，这样可以提高分离效果。效果。层析分离次序的选择同样重要，层

46、析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。层析、亲和层析、凝胶过滤。78根据分离纯化工艺的要求来选择根据分离纯化工艺的要求来选择 分离纯化工艺应遵循以下原则：分离纯化工艺应遵循以下原则：具有良好的稳定性和重复性具有良好的稳定性和重复性 尽可能减少组成工艺的步骤尽可能减少组成工艺的步骤 各技术步骤间要相互适应和协调各技术步骤间要相互适应和协调79 工艺过程中尽可能少用试剂工艺过程中尽可能少用试剂 工艺所用时间要短工艺所用时间要短 工艺和技术必须高效收率高工艺和技术必须

47、高效收率高易操作能耗低易操作能耗低 具有较高的安全性具有较高的安全性80第十一节第十一节 变性蛋白的复性变性蛋白的复性v外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低涵体蛋白质的复性率一般都很低。81一一.包涵体的特性与形成包涵体的特性与形成v1.1.包涵体的定义、组成与特性：包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成

48、无活性的固体颗粒。活性的固体颗粒。一般含有一般含有50%50%以上的重组蛋白，以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、其余为核糖体元件、RNARNA聚合酶、内毒素、外膜蛋聚合酶、内毒素、外膜蛋白白ompCompC、ompFompF和和ompAompA等，环状或缺口的质粒等，环状或缺口的质粒DNADNA，以及脂体、脂多糖等，大小为以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um0.5-1um，具有很高，具有很高的密度（约的密度（约1.3mg/ml1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMRNMR等新技术的应等新技术的应用表明

49、包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。复性的启动阶段中具有一定的作用。82v2 2包涵体的形成：包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。适，无法形成正确的次级键等原因形成的。v 2.12.1、基因工程菌的表达产率过高，超、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达因子的蛋白水解能力达到

50、饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。蛋白质无法达到足够的溶解度等。83v2.22.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显