基因工程与蛋白质工程课件.ppt
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- 基因工程 蛋白质 工程 课件
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1、1专题1 基因工程1、理解基因工程的原理和技术、理解基因工程的原理和技术2、理解基因工程的应用、理解基因工程的应用 3、蛋白质工程、蛋白质工程 考纲要求考纲要求基基 因因 工工 程程2v基因工程又叫做基因工程又叫做 _31、基因工程又叫做基因工程又叫做 _。基因工程基因工程2、“分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体3、1、目的基因的获取、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞(转化)、将目的基因导入受体细胞(转化)4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定 4黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端
2、限制性内切酶限制性内切酶一种限制性内切酶只能一种限制性内切酶只能识别识别双链双链DNA分子的某种特分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开(断开(切割切割DNA分子)分子)来源:来源:主要从原核细胞分离主要从原核细胞分离 作用作用:作用结果:作用结果:EcoRI基因工程的基因工程的“专用工具专用工具”平未端及粘性未端平未端及粘性未端5v下列四条下列四条DNA分子,彼此间具有粘性末端的分子,彼此间具有粘性末端的一组一组()v vABCD61、种类:、种类:2、作用部位:、作用部位:Ec
3、oli DNA连接酶连接酶(黏性末端)(黏性末端)T4 DNA连接酶连接酶(黏性末端和平末端黏性末端和平末端)磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来,即把梯子两边扶手的断口连接起来,这样一起来,即把梯子两边扶手的断口连接起来,这样一个重组的个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”78v运载体的特点运载体的特点v1.对受体细胞无害对受体细胞无害v2.外源基因的插入不影响载体在宿主细胞内外源基因的插入不影响载体在宿主细胞内v 的自我复制的自我复制v3.最好具有多个限制性内切酶的切点,供外
4、最好具有多个限制性内切酶的切点,供外源源DNA插入插入v4.具有标记基因,供重组具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择的鉴定和选择9v8除下列哪一项外,转基因工程的运载体必除下列哪一项外,转基因工程的运载体必须具备的条件是:(须具备的条件是:()vA能在宿主细胞中复制并保存能在宿主细胞中复制并保存 v B具有多个限制酶切点,以便与外源基因具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接连接vC具有标记基因,便于进行筛选具有标记基因,便于进行筛选 vD是环状形态的是环状形态的DNA分子分子D10人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因,该抗性基因的主要作用
5、是素抗性基因,该抗性基因的主要作用是 vA.提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 ()vB.有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测vC.增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量vD便于与外源基因连接便于与外源基因连接B11基因工程的一般程序基因工程的一般程序一、目的基因的获得一、目的基因的获得二、重组载体的构建二、重组载体的构建三、重组载体的导入和筛选三、重组载体的导入和筛选四、目的基因的表达与鉴定四、目的基因的表达与鉴定12(一)目的基因的提取(一)目的基因的提取目的基因:主要是指目的基因:主要是指_。获取方法:获取方法:1、直接分离法、
6、直接分离法2、人工合成法:反转录法;化学方法合成法、人工合成法:反转录法;化学方法合成法PCR反应合成反应合成DNA基本操作步骤基本操作步骤编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因原理:原理:DNA复制复制 过程:加热过程:加热DNA解链解链 冷却引物结合到互补冷却引物结合到互补DNA链链 互补链合成互补链合成 条件条件:耐高温:耐高温DNA聚合酶聚合酶 1314(一)目的基因的提取(一)目的基因的提取获取方法:获取方法:1、直接分离法、直接分离法2、人工合成法:反转录法;化学合成法、人工合成法:反转录法;化学合成法PCR反应合成反应合成DNA基本操作步骤基本操作步骤原理:原理:DNA复制复制
7、 过程:加热过程:加热DNA解链解链 冷却引物结合到互补冷却引物结合到互补DNA链链 互互 补链合成补链合成 条件条件:耐高温:耐高温DNA聚合酶聚合酶 15(二)基因表达载体构建二)基因表达载体构建1、基因表达载体由、基因表达载体由_、_、_、_四部分组成。四部分组成。目的基因目的基因启动子启动子标记基因标记基因 终止子终止子2、启动子作用:、启动子作用:3、标记基因的作用:标记基因的作用:RNA聚合酶识别和结合的位点聚合酶识别和结合的位点抗生素基因抗生素基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因,鉴别受体细胞中是否含有目的基因,筛选含有载体的细胞筛选含有载体的细胞16提醒提醒 17人工人工 目的目
8、的 标记标记 18三、重组载体的导入和筛选三、重组载体的导入和筛选受体细胞导入方法大肠杆菌转化法:获得转基因大肠杆菌酵母菌转化法:获得转基因酵母菌动物受精卵显微注射法:转基因动物植物体细胞农杆菌转化法、基因枪法:转基因植物植物受精卵花粉管通道法、基因枪法,转化法:转基因植物19三、重组载体的导入和筛选三、重组载体的导入和筛选农杆菌农杆菌转化法转化法体细胞体细胞将目的基因插入将目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNADNA上上显微注显微注射技术射技术受精卵受精卵将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的
9、基因的表达载体提纯取卵取卵获得受精卵获得受精卵显微注射显微注射早早期胚胎培养期胚胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为发育成为 具有新性状的动物具有新性状的动物Ca2+Ca2+处处理增大理增大细胞壁细胞壁通透性通透性原核原核细胞细胞或酵或酵母菌母菌用用Ca2+Ca2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组重组表达载体表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收 提醒提醒 唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。微生物做受体细胞主要是唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。微生物做受体细胞主要是个体微小个体微小,代谢旺盛代谢旺盛,繁殖速度快繁殖速度快,获得目的基因
10、产物多。植物细胞还可用基因枪法获得目的基因产物多。植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。和花粉管通道法。201 1、基因工程的基本工具、基因工程的基本工具(1 1)“分子手术刀分子手术刀”-。来源:主要是从来源:主要是从 生物中分离纯化出来的。生物中分离纯化出来的。功能:能够识别双链功能:能够识别双链DNADNA分子的某种分子的某种 的的 序列,并序列,并且切割特定的两个脱氧核苷酸之间的且切割特定的两个脱氧核苷酸之间的 ,形成黏性末端。,形成黏性末端。2 2、“分子缝合针分子缝合针”-。功能:缝合两个脱氧核苷酸之间的功能:缝合两个脱氧核苷酸之间的 。与与DNADNA聚合酶作用的异同:聚合酶作用
11、的异同:。3 3、“分子运输车分子运输车”-。最常用的载体是:最常用的载体是:。必须具备的条件:。必须具备的条件:4 4、目的基因的获取方法:、目的基因的获取方法:。5 5、将目的基因导入植物细胞,最常用的方法是、将目的基因导入植物细胞,最常用的方法是 ,其次,其次还有还有 和和 。受体细胞可以是受精卵、体受体细胞可以是受精卵、体细胞(经组织培养成为完整个体)。细胞(经组织培养成为完整个体)。将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是 。此方法的。此方法的受体细胞多是受体细胞多是 。复习回顾限制性内切酶限制性内切酶原核原核特定特定 脱氧脱氧核苷酸核苷酸磷酸二酯
12、键磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶缺口缺口载体载体细菌质粒细菌质粒直接分离法、人工合成法直接分离法、人工合成法农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法受精卵受精卵连接酶在两个连接酶在两个DNADNA片段之间形成磷酸二酯键片段之间形成磷酸二酯键DNADNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已存在的核聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段的酸片段的33端的羟基上,形成磷酸二酯键端的羟基上,形成磷酸二酯键21 基因表达指基因组中某基因在细胞中转基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为录为mRNAmRNA和翻译成蛋白质的过程。和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变
13、预示着细胞在分子水平上的变基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein22目的基因是否插入转基目的基因是否插入转基因生物染色体的因生物染色体的DNA:(四)目的基因的检测与鉴定四)目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达目的基因是否表达:目的基因是否转录目的基因是否转录:方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗原-抗体杂交抗体杂交鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测检测23检测检测24DNADNA分子杂交示意图分子
14、杂交示意图 采用一定的技术手段,将两种生物的采用一定的技术手段,将两种生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,那么,互补的碱基序列就会结合在一起,形成那么,互补的碱基序列就会结合在一起,形成杂合双杂合双链区链区;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离的单链。的单链。25基因文库基因文库v一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段插入到载体DNA分子中,所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体,将包含这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生
15、物体的基因文库。v将这些载体导入到受体细菌或细胞中,这样每个细胞就包含了一个基因组DNA片段与载体重组DNA分子,经过繁殖扩增,许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列,我们将这一个集合体叫做基因文库。v由于制备DNA片段的切点是随机的,所以每一克隆内所含的 DNA片段既可能是一个或几个基因,也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。262 2、下图为利用生物技术获得动物乳腺反应器和抗虫、下图为利用生物技术获得动物乳腺反应器和抗虫棉的过程,据图回答:棉的过程,据图回答:在基因工程中,在基因工程中,A A表示表示 ,如果直接从苏云金杆菌中,如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基
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