分离工程第三章课件.ppt

1、第三章沉 淀 与 泡 沫 分 离第一节第一节 沉沉 淀淀通过本章学习应掌握以下内容通过本章学习应掌握以下内容 沉淀（沉淀（Precipitation）：是物理环境的变化）：是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。现象。结晶：由溶解度降低引起的固体成相现象。结晶：由溶解度降低引起的固体成相现象。沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产物，相当于重结晶，沉淀分级目前目标产物，相当于重结晶，沉淀分级目前主要用于蛋白质的分离。主要用于蛋白质

2、的分离。多价金属离子聚电解质非离子型聚合物特殊沉淀剂热沉淀其他沉淀法有机溶剂沉淀等电点沉淀盐析沉淀沉淀法 常用沉淀方法的分类常用沉淀方法的分类一、盐 析 沉 淀（一）、原理 盐析（盐析（Salting-out）：蛋白质在高离子强度溶）：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象液中溶解度降低，发生沉淀的现象。Cohn经验方程：经验方程：IKSslog221iiZcI其中：S为蛋白质的溶解度；为常数；Ks为盐析常数；I为离子强度；ci和Zi分别为离子i的摩尔浓度和电荷数。盐析的机理还不十分清楚，但一般认为高离子盐析的机理还不十分清楚，但一般认为高离子 强度使蛋白质表面双电层变强度使蛋白质

3、表面双电层变 薄和水化程度降低。薄和水化程度降低。.Ks盐析法：盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；盐析法：盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量加入少量盐离子盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中中盐溶盐溶蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高浓

4、度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。盐析（盐析（NH4）2SO4）Electric double layer（二）、影响因素 1、蛋白质的分子量和立体结构、蛋白质的分子量和立体结构 分子量越大越易盐析，结构越不对称越易盐分子量越大越易盐析，结构越不对称越易盐析。析。2、对特定的蛋白质、对特定的蛋白质（1）无机盐种类（影响）无机盐种类（影响Ks)离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果较好。较好。选择盐析盐时还应考虑：选择盐析盐时还应考虑：a、溶解度大。、溶解度大。b、溶解度受温度影响较小；、溶解度受温度影响较小；c、盐溶液密度不高，利

5、于沉淀的沉盐溶液密度不高，利于沉淀的沉降或离心分离。降或离心分离。d、常用的盐析盐是常用的盐析盐是(NH4)2SO4，此，此外还有外还有Na2SO4和和NaCl。(2)温度和温度和pH值（影响值（影响）高离子强度下，温度升高，蛋白质高离子强度下，温度升高，蛋白质溶解度下降溶解度下降,减小。减小。pH值接近蛋白质值接近蛋白质pI值时，蛋白质溶值时，蛋白质溶解度最小。解度最小。(三)、盐析操作(以硫酸铵为例)确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实验步骤（设操作温度为验步骤（设操作温度为0）：）：取部分料液，分成等体积的几份，冷却至取部分料液，分成等体积的几份，

6、冷却至0；用下式计算饱和度（浓度相当于饱和浓度的百分用下式计算饱和度（浓度相当于饱和浓度的百分数）达到数）达到20100所需加入硫酸铵量，并在搅所需加入硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h以上，同以上，同时保持温度在时保持温度在0；212285.01505SSSW其中：W为硫酸铵加入量（g/L)；S1和S2为饱和度；505为0时硫酸铵饱和浓度（质量百分比，g/L）；0.285为0时硫酸铵饱和浓度（体积百分比，L/L）。3000g下离心下离心40min，将沉淀溶于，将沉淀溶于2倍体积的缓冲倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度；液中，测定其

7、中总蛋白和目标蛋白浓度；分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒；沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒；以上清液中总蛋白以上清液中总蛋白 和目标蛋白浓度对和目标蛋白浓度对 饱和度作图，从而饱和度作图，从而 可根据所要求达到可根据所要求达到 的目标蛋白纯化倍的目标蛋白纯化倍 数和回收率确定硫数和回收率确定硫 酸铵的加入量。酸铵的加入量。(四)、应用 由于盐析沉淀后产物中盐含量较高，故一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。思考题 蛋白质盐析沉淀后除盐采取什么方法蛋白质盐析沉淀后除盐采取什么方法？二、等电点沉淀

8、等电点等电点(pI)：蛋白质静电荷为零时的：蛋白质静电荷为零时的p H值为值为其等电点其等电点.利用利用 蛋白质在蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法（点沉淀法（Isoelectri precipitation）。）。操作条件：操作条件：低离子强度；pHpI。低离子强度调低离子强度调pH值至等电点，或在等电点的值至等电点，或在等电点的pH下利用透析方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。下利用透析方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。适用于疏水性大蛋白质（如酪蛋白），对于亲适用于疏水性大蛋白质（如酪蛋

9、白），对于亲水性强的蛋白质（如明胶）则不太适用。水性强的蛋白质（如明胶）则不太适用。特点：特点：优点：无需后续的脱盐操作。优点：无需后续的脱盐操作。缺点：由于操作缺点：由于操作pH过低，容易引起目标蛋过低，容易引起目标蛋白质的失活白质的失活.三、有机溶剂沉淀 定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。例：血浆蛋白质的分离纯化，至今仍用例：血浆蛋白质的分离纯化，至今仍用此法此法 当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲

10、水基团的水化程度降低，因而静电吸引力增大。操作条件：操作条件：低离子强度；等电点附近。低离子强度；等电点附近。加入有机溶剂充分搅拌，快速，蛋白加入有机溶剂充分搅拌，快速，蛋白质与有机溶剂接触时间短。质与有机溶剂接触时间短。特点：特点：优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；不需后续脱盐处理；分离；不需后续脱盐处理；缺点：易引起蛋白质变性，须在低温缺点：易引起蛋白质变性，须在低温下进行。下进行。本法应用，注意下列各点：本法应用，注意下列各点：（1）降低温度，能增加收率和减少蛋白）降低温度，能增加收率和减少蛋白质变性，加有机溶剂于水常为放热反应，质变性，加有机溶剂于水

11、常为放热反应，故操作时需冷却。故操作时需冷却。例：乙醇沉淀血浆蛋白，在例：乙醇沉淀血浆蛋白，在 -10 下进下进行。行。（2）所选溶剂必须能与水互溶，而和蛋）所选溶剂必须能与水互溶，而和蛋白质不起作用，常用乙醇、丙酮。白质不起作用，常用乙醇、丙酮。（3）蛋白质分子量越大，产生沉淀需加入的有机溶剂量越少。如用丙酮作沉淀剂有下列关系式：所需丙酮量=1.8-0.12蛋白质分子量（4）一种蛋白质溶解度会由于另一种蛋白质存在而降低。（5）沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。（6）接近等电点时，引起沉淀所需加入）接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂量少。有机溶剂量少。（7）少量中性盐（）少量中性盐

12、（0.10.2molL-1)的存在的存在能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白质所液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白质所需有机溶剂量增大，一般需有机溶剂量增大，一般 I=0.05 或稍低或稍低为最好，既能使沉淀迅速形成，又能对为最好，既能使沉淀迅速形成，又能对蛋白质起保护作用。蛋白质起保护作用。（8）盐析法制蛋白质透析除盐，进一步）盐析法制蛋白质透析除盐，进一步纯化可用有机溶剂沉淀。纯化可用有机溶剂沉淀。四、热沉淀（Thermal precipitation)定义：利用在较高温度下，热稳定性差定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生

13、变性沉淀的现象，分离纯的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。化热稳定性高的目标蛋白的方法。热沉淀基于蛋白质的变性动力学。热沉淀基于蛋白质的变性动力学。假设变性过程符合一级反应规律：假设变性过程符合一级反应规律：RTEDDDzektkccckdtdc0ln 操作条件：操作条件：调节调节pH；加入有机溶剂。加入有机溶剂。特点：特点：是一种变性分离法，带有冒险性，需是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。有充分了解。五、其他沉淀法（一）、非离子型聚合物沉淀法 机理不清，可能是降低蛋白质分子表面的水机理不清，

14、可能是降低蛋白质分子表面的水化程度或空间排阻作用。化程度或空间排阻作用。常用聚合物：常用聚合物：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）。PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒、是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒、不可燃烧且对大多数蛋白质有保护作用。不可燃烧且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀分离蛋白质的优点：沉淀分离蛋白质的优点：1、体系温度只须控制在室温下。、体系温度只须控制在室温下。2、沉淀的颗粒较大，产物易收集。、沉淀的颗粒较大，产物易收集。3、PEG不会使蛋白变性。不会使蛋白变性。PEG沉淀分离蛋白质的缺点：沉淀分离蛋白质的缺点：PEG很难从蛋白质溶液中除去，须用超滤很难从蛋白质溶液中除去，须用

15、超滤和液和液-液萃取解决。液萃取解决。PEG分子量需大于分子量需大于4000，最常用，最常用6000和和20000。所用所用PEG浓度通常为浓度通常为20%，浓度再高会，浓度再高会使黏度增大，造成沉淀回收困难，若使黏度增大，造成沉淀回收困难，若PEG对后继分离步骤影响较小，可以不对后继分离步骤影响较小，可以不必除去必除去。蛋白质溶解度与蛋白质溶解度与PEG浓度之间的关系：浓度之间的关系：lgS=lgS0-kPEG S:PEG存在时浓度，存在时浓度，S0:无无PEG时浓度，时浓度，k:常数，与蛋白质和常数，与蛋白质和PEG分子大小有关。分子大小有关。（二）、聚电解质沉淀法 沉淀机理：与絮凝类似，

16、在蛋白质之沉淀机理：与絮凝类似，在蛋白质之间起架桥作用，同时还兼有盐析作用。间起架桥作用，同时还兼有盐析作用。应用：主要用于酶和食品蛋白的回收应用：主要用于酶和食品蛋白的回收 常用的聚电解质：酸性多糖、海藻酸常用的聚电解质：酸性多糖、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶和羧甲基纤维盐、果胶酸盐、卡拉胶和羧甲基纤维素等。素等。聚电解质是长链状结构，链上有许多活性聚电解质是长链状结构，链上有许多活性官能团，如：官能团，如：-COOH、NH4+等离子型基等离子型基团，通过静电引力、范德华力、氢键强烈团，通过静电引力、范德华力、氢键强烈吸附胶体表面，产生架桥作用。链越长，吸附胶体表面，产生架桥作用。链越长，活性

17、基团越多，效果越好。活性基团越多，效果越好。（三）、金属离子沉淀法 沉淀机理：可与蛋白质分子上的某些残沉淀机理：可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋白质沉淀。基发生作用而使蛋白质沉淀。如如Ca2+和和Mg2+能与羧基结合，能与羧基结合，Mn2+和和Zn2+能与羧基、含氮化合物以及杂环化能与羧基、含氮化合物以及杂环化合物结合。合物结合。优点：优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀；沉淀后可使浓度很低的蛋白质沉淀；沉淀后金属离子可用离子交换树脂或螯合剂金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。除去。第二节 泡 沫 分 离自 学思考题 1、名词解释：盐析和盐溶、蛋白质的等电点、蛋白质变性。2、扼要解释为什么大多数球状蛋白质在溶液中具有下列性质？（1）在低pH值时沉淀。（2）当离子强度从零逐渐增加时，其溶解度开始增加，然后下降，最后出现沉淀。（3）在一定离子强度下，达到等电点 pH值时，表现出最小的溶解度。（4）加热时沉淀。（5）加入一种可与水混溶的非极性溶剂减小其介质的介电常数，而导致溶解度的减小。（6）如果加入一种非极性强的溶剂，使介电常数大大地下降会导致变性。