核酸的制备及基因组文库的构建学习培训模板课件.ppt
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1、核酸的制备及基因组文库的构建核酸的制备及基因组文库的构建一、核酸制备的基本原理二、核酸制备的基本方法三、质粒DNA的制备四、基因组DNA的制备五、RNA的制备六、基因组、cDNA文库的构建主要内容主要内容一、核酸制备的基本原理DNA主要存于细胞核中,其它如线粒体和质体等,也含有少量DNA。RNA主要存于细胞质中,其它如线粒体和核仁等也含有RNA。在生物体中,DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存在。核酸不溶于一般有机溶剂。原核细胞与真核细胞 菌毛原核细胞简示图原核细胞的主要结构有细胞膜、细胞质、核糖体,以及由一条裸露的 DNA 双链所构成的拟核。拟核没有与细胞质部分相隔开的界膜(核膜),这是与真
2、核细胞的主要区别。真核细胞中只有植物细胞有细胞壁。原核细胞中的DNA没有组蛋白(histone)与之结合。无有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis),DNA复制后,细胞随即分裂为二。拟核 核糖体真核细胞简示图真核细胞含有细胞核。DNA与组蛋白等蛋白质共同组成染色体结构,在核内可看到核仁。真核生物进行有性繁殖,并进行有丝分裂。也有些真核生物的细胞也能进行无丝分裂,如人的肝脏细胞。核酸制备的基本原理1、细胞破碎2、将核蛋白解联,即利用解联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白。3、精致纯化核酸注意事项:操作过程应避免核酸的降解,包括化学因素(如过酸过碱),物理因素(如强烈振荡、高温、辐射等),生
3、物酶等二、核酸制备的基本方法(一)细胞破碎1、物理方法 机械碾碎:对于动物组织(如鼠肝),一般多采用匀浆的方法。组织捣碎器:是一种剧烈的破碎的方法,必须保持低温,时间不宜太长。超声波:借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。压榨法:是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔,使细胞被挤压破碎。2、溶胀和自溶 溶胀:在低渗溶液(如低浓度的稀盐溶液中),由于存在渗透压差,溶剂分子将大量进入细胞,致使细胞膜膨胀破裂。自溶:细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下,发生溶解。应用此法要特别小心,防止目的核酸被分解。3、化学处理用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯
4、仿、甲苯等)或表明活性剂(SDS)处理细胞时,可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解,导致细胞破碎。4、生物酶降解如溶菌酶等生物酶有降解细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时,先是细胞壁消融,然后是渗透压引起的细胞膜破裂,导致细胞破碎。各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母4超声法细胞混悬液5反复冻融法培养细胞6冷热交替法细菌、病毒7高压破碎细菌、细胞8有机溶剂细菌、酵母9去垢剂组织、培养细胞10酶解法细菌、酵母简单介绍几种常用的细胞破碎仪器(二)核酸提取1、阴离子去污剂(SDS)法:SDS(sodium dodecyl sulfate)即十二烷
5、基硫酸钠,是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变性剂。利用SDS的非极性基团破坏蛋白分子的次级键,使蛋白变性,使核蛋白解联。应注意的是:变性后蛋白仍在溶液中,可在室温条件下加入1/2体积饱和硫酸铵使蛋白沉淀。2、酚抽提法:酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。现有许多派生的方法。(1)酚水法 一般向溶液中加入等体积用水或缓冲溶液饱和的重蒸酚(除去氧化物醌),在室温下或低温下摇动混合。变性蛋白分子表面由于含有很多极性基团与苯酚相似相溶,从而变性蛋白分子(以及细胞残渣)溶于酚相,而核酸和多糖溶于水相。其中间为不溶性变性蛋白质。离心分层后取出水层,多次重复操作,直至中间层无明显变性蛋
6、白为止。然后合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀核酸。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。酚抽提法示意图受pH影响很大,若pH为中性偏酸,利于RNA的抽提;若pH略偏碱,利于DNA的抽提。例如,DNA在水饱和酚的酸性条件下容易留在有机相。因此,DNA和RNA的酚抽提法的pH值是不同的。(2)酚/氯仿法:由于酚水法中的缺点是:能溶解10-15%的水,从而溶解一部分核酸。因此,加入氯仿。氯仿的作用是氯仿的作用是:克服酚的缺点,加速有机相与水相分层。另外,最后用氯仿抽提还可去除核酸溶液中的迹量酚(酚易溶于氯仿中)。该法中也常加入异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。(3
7、)热酚法 此法系向抽提液中加入热酚,于65度水浴振荡抽提,离心去酚后,再反复抽提3-4次(加热时间不要超过10min)。目前该法已成为由动物和细菌细胞制备RNA的标准方法。(4)SDS-酚法 酚与SDS结合,是适用范围最广的方法之一。Phase Lock Gel-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侣 对于核酸纯化,常使用酚/氯仿抽 提。然而,实验中常需要面对不同相层的不稳定。为避免将蛋白杂质或有机相连同上清水相一起吸出,我们往往会弃去一部分上清,这样会造成相当一部分样品损失,特别是小体积的酚抽。反之,如果不小心混入了有机相,又会对下游实验产生抑制作用。国内天根(Tiangen)公司有个产品:Phase
8、Lock Gel(PLG)。只需将酚氯仿和样品的混合物加入预装有PLG的管子里,离心,PLG化合物就会在水相和有机相之间形 成一层致密的固体,将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下,这样,全部水相样品可轻松吸出,完全不用担心混入杂质,也不用担心酚氯仿会不小心流 出来。3、浓盐法:高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级键,使核蛋白解联。一般先用1MNaCl或1MNaClO4进行抽提,再加入氯仿/异戊醇(起消泡作用),变性蛋白停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,然后用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。该法对核酸的损伤较小,但去除蛋白不够彻底,常与其它方法结合使用。如
9、经高氯酸钠处理后,采用CsCl密度梯度离心,便可将蛋白全部去除。4、高通量的RNA分离技术:(1)微量移液法 借助毛细管或微量移液管直接提取细胞的内含物,进行RNA的抽提。(2)激光微解剖法 将被冷冻或被石蜡包埋的组织切成薄片,然后所需部位被激光解剖下来,再利用黏膜吸附,转移到RNA提取液。(3)原生质体分离法 此法首先将荧光蛋白(GFP)转入受体细胞,用酶处理破壁后,通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的细胞产生荧光,再通过荧光感受分离仪将其分离出来,进而制得RNA。(三)核酸的浓缩和沉淀1、核酸的浓缩DNA含量低且容积大时,需浓缩。(1)真空干燥法 此法比较温和,适用于小量样品的浓缩(2)丁
10、醇抽提浓缩法 丁醇能吸收大量水,而DNA不溶于丁醇。(3)聚乙二醇(PEG)吸收沉淀法。将DNA溶液装入透析袋,包埋在PEG中,PEG吸水液化,DNA溶液体积减小。2、核酸的沉淀核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物,它与钠、钾、鎂形成的盐在多种有机溶剂中不溶解,也不会变性。(1)常用于沉淀核酸的盐类:NaAC,NaCl,KAC,MgCl2等。(2)沉淀核酸的有机溶剂:乙醇,异丙醇,PEG等。(3)离心(四)核酸的纯化核酸纯化的方法很多,如酚/氯仿抽提法、超速离心、柱层析、免疫沉淀、凝胶电泳等。柱层析法以硅基质作为填充层析柱的树脂,DNA在高盐的条件下,DNA的磷酸二酯骨架脱水,通过暴露的磷酸盐残基
11、与硅基质结合,而蛋白等杂质不能结合到柱上,可用75%的乙醇洗去杂质;而在低盐条件下,DNA又可从柱子上释放处理,所以可通过再加入TE或水,离心洗脱。讨论 核酸的分离与鉴定质质 粒粒 DNA DNA 制制 备备 质粒质粒(plasmid)(plasmid)是是细菌内独立于基因组(大细菌内独立于基因组(大环状环状DNADNA)并能自我复制的小环状并能自我复制的小环状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。这些质粒都是独立于细菌基因组这些质粒都是独立于细菌基因组DNADNA之外进行之外进行复制和遗传的复制和遗传的辅助性遗传单位辅助性遗传单
12、位。质粒是携带质粒是携带外源基因外源基因进入细菌中扩增或进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种表达的重要媒介物,这种基因运载工具基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值,在基因工程中具有极广泛的应用价值,而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术本的实验技术 质粒的结构特点质粒的结构特点v 分子量相对较小分子量相对较小v 共价闭合分子共价闭合分子v 双链环状结构双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力具有更强的抗切割和抗变性能力质粒上的元件包括启动子,多克隆位点,终止密码,融合Tag,筛选标记/报告基因等 细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒
13、DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 一、细菌的培养一、细菌的培养 (bacterial culture)(bacterial culture)l l 先分离单个菌落,接种到含少量适当抗先分离单个菌落,接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增,随着细菌的生长生素的培养基中扩增,随着细菌的生长,质粒,质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。二、细菌的收集二、细菌的收集(bacterial collection(bacterial collection)细胞生长过程中,排出大量代谢产物,为了细胞生长过程中,排出大量代谢产物,为了提高质粒提高质粒DNAD
14、NA的纯度,的纯度,离心弃上清,细菌离心弃上清,细菌沉淀最好用沉淀最好用STESTE或生理盐水悬浮或生理盐水悬浮,漂洗,漂洗l-2l-2次,离心管壁上的液体也应该仔细去除干次,离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。净。三、细菌裂解细胞的裂解方法很多,如去污剂法,沸水热裂法、碱裂解法,有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊,一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。v大质粒(大质粒(15kb)的处理方法:的处理方法:采用温和处理方法采用温和处理方法,使用蔗糖、溶菌酶、,使用蔗糖、溶菌酶、EDTA,后再使用后再使用SDS裂解,使裂解,使plasmid损伤减少损伤减少
15、v小质粒(小质粒(15kb)的处理方法:的处理方法:无需特殊处理,无需特殊处理,碱裂解方法碱裂解方法等均可使用等均可使用1.在NaOH存在的强碱性(pH12.012.6)条件下,用碱和SDS破坏细胞壁和裂解细胞,并使细胞的蛋白质与DNA发生变性,释放出质粒DNA。2.在pHl2.0-12.6碱性环境中,大分子量细菌基因组DNA完全变性,而共价闭环(CC)质粒DNA的大部分氢键也断裂,但两条互补链不会完全分离。3.将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下,大部分基因组DNA(无法复性)和蛋白质形成沉淀,而CC质粒DNA复性,仍然为可溶状态。4.经离心分离,质粒DNA保留在上清液中。5.再用酚/氯仿
16、抽提或柱层析法进一步纯化质粒DNA。碱裂解法原理碱裂解法原理14ml培养细菌收集培养细菌收集细菌菌体重悬细菌菌体重悬细菌破裂溶解、染色体基因组和蛋白质细菌破裂溶解、染色体基因组和蛋白质变性、变性、质粒变性质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性质粒复性Solution ISolution IISolution III进一步分离、纯化质粒进一步分离、纯化质粒DNA碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA,pH 8.0,100ug/ml RNAse0.2 M
17、 NaOH/1%SDS(要柔和)4M 盐酸胍,0.75MKAc,用HAc调pH为44.5。碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。质粒质粒DNADNA的进一步纯化的进一步纯化 1.CsCl-EB法 2.聚乙二醇沉淀法 3.柱层析法 4.酚/氯仿法CsCl-EB 密度梯度离心法vEB插入相邻的碱基之间,降低了DNA的浮力密度。在过量EB存在下,蛋白质的密度最小位于最上层;RNA密度最大沉于管底;DNA位于中间。vCsCl可以用丁醇抽提,透析除去。纯度可达100%。简单介绍 利用试剂盒提取质粒DNA 建立基因组文库;建立基因组文库;克隆特定的基因;克隆特
18、定的基因;用用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数;印迹检测某一基因的存在和拷贝数;用用 PCR 反应检测基因的存在及突变等反应检测基因的存在及突变等.从细胞或组织中提取的基因组从细胞或组织中提取的基因组 DNA 的目的的目的基因组基因组 DNA 的制备的制备1 1、DNADNA样品准备样品准备 常见的标本:常见的标本:血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织:生物组织:最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存 70 70或液氮或液氮基因组基因组 DNA 的制备步骤的制备步骤2、DNA提取提取 (1 1)酚抽提
19、法:)酚抽提法:首先用首先用EDTAEDTA、SDS SDS(对于细菌也可用溶菌酶)(对于细菌也可用溶菌酶)、蛋白、蛋白酶酶K K溶液破碎细胞,消化蛋白溶液破碎细胞,消化蛋白,然后用,然后用pH8pH8的的TrisTris饱和饱和酚或酚酚或酚-氯仿氯仿抽提抽提DNADNA,然后然后0.1 0.1 倍体积的倍体积的 3 M NaAC 3 M NaAC 和和 2.5 2.5 倍体积的倍体积的 100%100%乙醇沉淀乙醇沉淀 DNADNA,并用并用 70%70%乙乙醇除去醇除去 DNA DNA 沉淀中的盐离子沉淀中的盐离子。最后将基因组最后将基因组 DNA DNA 溶溶解在解在 TE TE 缓冲液
20、缓冲液中,使其终浓度为中,使其终浓度为 1 mg/ml1 mg/ml,置,置 4 4 C C 保存。保存。一些RNA,尤其是mRNA会在苯酚处理过程中去除,但大多数RNA和DNA一起保留在水相,因此最有效去除RNA污染的方法就是加RNAse。(2 2)甲酰胺解聚法:甲酰胺解聚法:v破碎细胞同上,然后用破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解高浓度甲酰胺解聚蛋白质与聚蛋白质与DNADNA的结合的结合,再透析获得,再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的的复合物,可以使蛋白质变性。复合物,可以使蛋白质变性。减少了酚减少了酚多次抽提的步骤多次抽提的步骤
21、v甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。(3 3)玻璃棒缠绕法:玻璃棒缠绕法:v用用盐酸胍裂解细胞盐酸胍裂解细胞,将裂解物,将裂解物铺于乙醇上铺于乙醇上,然后用带钩,然后用带钩或或U U型玻璃棒在型玻璃棒在界面轻搅,界面轻搅,DANDAN沉淀液绕于玻棒沉淀液绕于玻棒。生成。生成DNADNA约约8080kbkb。(4 4)表面活性剂快速制备法:表面活性剂快速制备法:v用用Triton X-100Triton X-100或或NP40NP40表面活性剂破碎细胞表面活性剂破碎细胞,
22、然后用蛋,然后用蛋白酶白酶K K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。v方法包括方法包括透析、层析、电泳及选择性沉透析、层析、电泳及选择性沉淀。淀。v电泳法简单、快速,是电泳法简单、快速,是DNA样品纯化最样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。电泳。3、DNA的纯化的纯化4、DNA的浓缩v1 1、固体聚乙二醇(固体聚乙二醇(PEGPEG)浓缩:浓缩:v2 2、丁醇抽提浓缩:丁醇抽提浓缩:DNADNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但DNADNA不会。因此重复几次可显著减少不会。因此重复几次可显
23、著减少DNADNA体积。体积。5、DNA的检测溴乙锭染色溴乙锭染色:在在254254nmnm紫外光下检测,如需回收最好在紫外光下检测,如需回收最好在300300nmnm紫外光紫外光下割胶,否则易使嘌呤断链,在下割胶,否则易使嘌呤断链,在1 1cmcm宽带上可检到宽带上可检到1010ng DNAng DNA。银染法银染法:AgAg+与与DNADNA形成复合物,在甲醛还原下可染成黑褐色,灵敏形成复合物,在甲醛还原下可染成黑褐色,灵敏度高度高200200倍,但不能回收。倍,但不能回收。6、DNA的回收由于基因组DNA片段大,在离心过柱时可能被“扯断”,因此常规的离心过柱的方法并不 适合大片段DNA的
24、回收。经典方法是电洗脱。其原理是是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中,通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相,回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。低熔点琼脂糖(需加热到65溶解)和琼脂糖酶消化也是常用方 法,均使DNA溶回溶液,然后使用酚抽提法回收DNA。另外还有玻璃珠洗脱法或者其它纯化填料。玻璃珠洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液,然后加入玻璃珠结合DNA,经分离、洗涤后,在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。(1)防止内源性防止内源性 DNase 裂解缓冲液中的裂解缓冲液中的 EDTA使使 DNA免遭免遭 DNase 的降解。的降解。(2)保证得到高分子量的基因组保证得到高
25、分子量的基因组 DNA 在制备基因组在制备基因组 DNA 过程中应减少物理机械作用,过程中应减少物理机械作用,防止基因组防止基因组 DNA 的损伤。的损伤。(3)保证基因组保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染,否则将影响不被蛋白质所污染,否则将影响限制性内切酶对限制性内切酶对 DNA 的酶切作用。的酶切作用。高纯度高纯度 DNA 的的 OD260/OD 280 值大于值大于 1.7。制备基因组制备基因组 DNA 时应注意时应注意哺乳动物基因组哺乳动物基因组 DNA1,6.DNA/HindIII;2,3.大鼠基因组大鼠基因组 DNA;4,5.小鼠基因组小鼠基因组 DNA基因组基因组 DNA 的检
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