流式细胞术基本原理课件.ppt

1、流式细胞术基本原理流式细胞术基本原理陈晓东陈晓东 产品技术专员产品技术专员广州市珈源医学试剂有限公司广州市珈源医学试剂有限公司 流式细胞术流式细胞术=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）是一种）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等物、及人工合成微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学

2、特征，并加研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量以定量 流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点单个细胞单个细胞/生物颗粒分析生物颗粒分析同时多参数、多荧光分析同时多参数、多荧光分析高通量检测高通量检测/高速度高速度 10000个细胞个细胞/秒以上秒以上定性定性/定量分析定量分析分选特定性状或功能的细胞分选特定性状或功能的细胞可检测的样本种类多样可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 目前流式细胞仪可以检测的类别目前流式细胞仪可以检测

3、的类别细菌细菌浮游生物浮游生物DM：0.2m 15m0.2m 15m 单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞红细胞 流式细胞仪的基本构造流式细胞仪的基本构造 激光发射器激光发射器发出所需要的波长的激光发出所需要的波长的激光前向散射光检测器前向散射光检测器侧向散射光检测器侧向散射光检测器光学滤镜光学滤镜流动室与液流系统流动室与液流系统：将：将细胞单个压入流动室细胞单个压入流动室信号收集与数据信号收集与数据处理系统处理系统光源与光学系统光源与光学系统 Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液鞘液流动室流动室 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收当光子遇到滤片

4、时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。，或被滤片反射。光学滤片光学滤片 光学滤片的种类光学滤片的种类 长通滤片（长通滤片（LP）：）：630LP 短通滤片（短通滤片（SP）：）：550SP 带通滤片（带通滤片（BP）:488/10 共有两类：散射信号散射信号与荧光信号荧光信号前向角散射散射信号（FSC）反映细胞大小侧向角散射散射信号（SSC）反映细胞颗粒度荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3）胞内、胞外染色情况流式细胞仪可获取的信号种类 FSC和和SSC直方图直方图流式细胞仪显示图的种类流式细胞仪显示图的种类 把前向散射光图和侧把前向散射光图和侧向散射光图的一维图向散射光

5、图的一维图像在二维图像上投影，像在二维图像上投影，便是我们平常所看到便是我们平常所看到的流式图。的流式图。所以横坐标表示的是所以横坐标表示的是细胞的直径大小；纵细胞的直径大小；纵坐标表示的是细胞的坐标表示的是细胞的复杂程度。复杂程度。两者相结合就能说明两者相结合就能说明细胞种类细胞种类散点图散点图 二维等高图和密度图二维等高图和密度图 假三维图与三维图假三维图与三维图Pseudo 3D Plot3D Plot 流式细胞仪如何获取细胞信号？FSCSSCFL 前向角信号（前向角信号（Forward Scatter，FSC）前向角信号：细胞的大小前向角信号：细胞的大小 FSCCountFSCCoun

6、t101000 侧向角信号（侧向角信号（Side Scatter，SSC）SSCCountSSCCount101000 FL countFL FSC、SSC、FL 如何分离90角内的各种荧光信号？荧光染料吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的光波的物质激发光激发光PI488n600nm 荧光染料种类荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 红色红色PI 488 620 DNA染色 橙红橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红橙红PeCy5 488

7、 675 免疫荧光 红色红色APC 633 670 免疫荧光 红色红色DAPI 359 462 DNA染色 蓝色蓝色 荧光染料光谱特征 荧光分离原则在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光 开放式光路Calibur、Influx流式细胞仪的光路 封闭式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）分选分选将目标细胞分离并富集，进行后续研究。分选纯度99%震荡震荡激光激光 偏转板Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto t

8、est tubesFALS SensorFluorescence detector 几个概念u信号放大模式u信号类型uCV值u样本流速u激光延迟u液滴延迟u荧光补偿u阈值u门u对照 信号放大 PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变光信号光电倍增管（PMT）放大器电信号放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）线性放大（lin）按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物过程的信号，如DNA含量、总蛋白含量等。对数放大（log）按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量中通常使用对数放大。电脉冲信号类型将与电脉冲信号 强弱相关的电压

9、数字化有三类电脉冲信号 高度信号H 面积信号A 宽度信号W CV值CV值（变异系数）：样品均一度及仪器分辨率的标志CV值一般2%样本流速 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。样本流速选择 激光延迟（laser delay）Laser 1Laser 2 液滴延迟（drop delay）颜色补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检测器，则如图：理想状态实际情况补偿

10、效果阴性对照 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。屏蔽噪音信号和碎片信号 门（Gate）分析/分选感兴趣的细胞群 对照同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合到组织细胞而产生的背景染色。空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。阳性对照：即已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。谢谢！