血液学第二节第三节课件.ppt

1、第二节 细胞化学染色检验 v细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。细胞化学染色临床上用于：v辅助判断急性白血病的细胞类型。因为不同细胞系列，其所含的化学物质成分、分布及含量各有不同，且随着细胞的逐渐成熟，化学物质的含量等发生相应的变化。因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断所属的细胞系列，如过氧化物酶染色、非特异性酯酶染色、特异性酯酶染色等。故临床上急性白血病细胞类型的判断需要结合细胞化学染色。辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。因为血细胞在病

2、理情况下，其化学物质成分及含量会发生改变，以辅助疾病的诊断，如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。观察疾病疗效和预后。发病机制的探讨。所以，细胞化学染色是诊断血液系统等疾病不可缺少的手段。v不同细胞化学染色，染色步骤不同，但基本步骤为固定、显示及复染。v1、固定 为了保持细胞结构及化学成分的不变，需对细胞进行固定。根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法固定，临床上常用的是化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定，分为蒸气固定和液体固定。v（1）蒸气固定：甲醛是一种常用的固定剂，甲醛极易挥

3、发、氧化，故常用40%甲醛进行蒸气固定。即在较封闭的玻璃器皿中加入40%甲醛，将涂片血膜朝下，固定510min。v（2）液体固定：将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可用两种或两种以上固定液混合面成，如10%甲醛甲醇液、甲醛丙酮液等。v2、显示 通过不同化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，显示出被检测的化学物质。常用的化学反应种类有以下几种：v（1）偶氮偶联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘粉，萘粉与重氮盐结合，偶氮偶联形成有色沉演。重氮盐的种类有坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六偶氮付品红等。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。v（2）

4、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶，能分解过氧化氢释放出新生态氧，使无色的联苯胺氧化形成有色沉淀，如过氧化物酶染色。v（3）普鲁士蓝反应：细胞内、外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成如亚铁氰化钾蓝色沉淀，如铁染色。v（4）雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸-雪夫反应。v（5）金属沉淀法：金属及其化合物一般都有颜色，故形成的沉淀物为有色物质，如钙钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色。v3、复染 复染的目的在于使各种细胞能显示出来以便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，既能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化

5、学染色结果。如铁染色复染常用中性红，过碘酸-雪夫反应常用甲基绿。对核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。v复染后，首先要通过显微镜观察染色是否成功（如过氧化物酶染色、碘酸、雪夫反应等可观察中性成熟粒细胞是否呈强阳性），然后观察相应细胞的染色结果并报告结果，结果的报告一般包括阳性率、积分或阳性分布情况。v细胞化学染色的种类有很多，下面介绍过氧化物酶染色、苏丹黑染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色、铁染色及酯酶染色。酯酶有多种，根据PH不同分为酸性、中性和碱性酯酶；根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶和非特异性酯酶。非特异性酯酶包括酸

6、性非特异性酯酶（即酸性a-醋酸蔡酚酯酶）、碱性非特异性酯酶（即a-丁酸蔡酚酯酶）和中性非特异性酯酶，后者包括a-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。下面逐项介绍各种细胞化学染色。一、过氧化物酶染色一、过氧化物酶染色v原理 过氧化物酶(peroxidase,POX)染色方法有Washburn法、四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等。前者曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，故现常用后两者，下面分别介绍这两种方法的原理。v四甲基联苯胺法 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，POX能分解H2O2而释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合

7、，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。v改良的Pereira染色法 粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧，使碘化钾氧化生成碘，碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀，定位于酶活性的细胞质内。正常血细胞的染色反应v1、粒细胞系统 分化差的原粒细胞为阴性，分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性；且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强。中性分叶核粒细胞为强阳性反应，但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；嗜酸性粒细胞阳性最强，其阳性颗粒粗大、有折光性；嗜碱性粒细胞为阴性。v2、单核细胞系统 大多数单核细胞系统的细胞呈阴性或弱阳性，阳性颗粒少而细小。v3、其他细胞

8、淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，吞噬细胞有的呈阳性。v临床评价 POX染色是临床上辅助判断急性白血病细胞类型首选、最重要的细胞化学染色。但在观察要辨认的细胞POX染色结果前，首先要注意观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。v1、帮助鉴别急性白血病的类型v（1）急性粒细胞白血病，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多，较粗大，常呈局限性分布，但阴性时也不能排除本病；急性淋巴细胞白血病时，原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞均呈阴性反应，但可有少许阳性细胞，此系残留的原粒细胞，故FAB分型规定急性淋巴细胞白血病其阳性率10%），并伴有吞噬细

9、胞增加，形成“星空样”图像。巨核细胞增加，但形态正常；嗜酸性和嗜碱性粒细胞有时较多；核分裂象多见，但无病理性核分裂象；间质轻度水肿，出血，网状纤维无异常改变，部分慢粒可发展成或伴有骨髓纤维化，此时网状纤维可增加。v8、慢性淋巴细胞白血病 骨髓增生极度活跃，正常造血组织部分或完全受抑制，脂肪细胞大部分或完全消失；细胞组成以单型性小圆淋巴细胞多见，大淋巴细胞型较少见，大、小淋巴细胞混合型罕见，形态常较一致，细胞呈弥漫，结节或漫合性浸润；结节一般大于骨髓内的正常淋巴小结且无生发中心；切片可见局限性纤维组织增生；可有骨小梁破坏现象，可见骨碎片，间质充血。v9、骨髓增生异常综合征 骨髓增生明显或极度活跃

10、（约15%的MDS属增生减退型）。切片内除可检出红系病态造血外，多数尚可检出巨核系病态造血现象。切片内出现35个以上原始与早幼粒细胞聚集成簇，位于小梁间区或小梁旁区者，这种现象称之为未成熟前体细胞异常定位，对诊断有较大特异性。骨髓组织学特征之一是切片内检出不典型微巨核细胞，直径1015um，在真空和冷处理的塑包切片上呈a-萘酚醋酸酯酶（ANAE）强阳性。间质水肿，出血，肥大细胞，浆细胞增多。（5）间质内可见嗜酸，嗜碱性粒细胞浸润。v10、多发性骨髓瘤 骨髓增生明显活跃，脂肪细胞与正常造血组织均减少，以小梁间区不同分化程度的浆细胞弥漫性浸润占优势，正常骨髓结构被破坏。切片以单一性瘤细胞浸润为主，

11、当肿瘤性浆细胞分化较好时，形态类似于正常成熟浆细胞，当瘤细胞分化较差时，异形性大。核仁明显，胞质嗜碱性，胞质及核内常可找到嗜酸性包涵体，为识别浆细胞的特征之一。有人认为骨髓内浆细胞均一性，结节性聚集最具诊断价值。间质水肿，出血，基质增多。v11、恶性组织细胞病 骨髓增生活跃或增生明显活跃，造血组织与脂肪组织容积一般正常，早期骨髓组织结构多数仍保持正常，随病情进展，骨髓正常组织被破坏。幼红细胞岛及幼粒细胞岛增生正常，巨核细胞形态与数量基本正常。肿瘤性组织细胞可分为5种类型：淋巴样组织细胞，单核样组织细胞，吞噬样组织细胞，异常组织细胞及多核巨细胞型组织细胞，其中具有较高诊断价值的是异常组织细胞及多

12、核巨细胞型组织细胞。v12、骨髓纤维化 骨髓造血组织容量早期正常，晚期减少，脂肪组织容量也减少，骨髓基质增多。造血组织与纤维增生，变性区相互交织，可见成纤维细胞在切片中弥散分布。单位面积内巨核细胞增多或正常，常聚集成簇，且具明显多形性，其他造血细胞数量减少，甚至仅残留少数不典型的幼稚及成熟细胞。v13、真性红细胞增多症 骨髓增生多数（82.4%）呈极度活跃，脂肪细胞消失，血窦受压而狭窄；或增生较活跃(17.6%)，可见少数脂肪细胞。粒、红、巨核三系细胞不同程度增生，呈散在分布。粒系细胞增生活跃，各阶段比例与分布均正常，近骨小梁表面偶见成片的早幼、中幼粒细胞；远离骨小梁区，杆状，分叶核粒细胞较多，嗜酸性粒细胞增多。骨小梁旁常见扩张的血窦，窦内充满粒、红系各阶段细胞。红系细胞增生活跃，各阶段细胞常呈散在分布，不呈岛状，各阶段比例无明显异常，可见凋亡红系细胞。巨核细胞增生活跃，呈散在、蔟状甚至片状分布。以成熟多叶核巨核细胞多见，其胞体较大，还可见单圆核巨核细胞，裸巨核细胞，无核巨核细胞及小巨核细胞。淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞等非造血细胞少见，偶见胶样变性。可伴有骨小梁减少，变细或虫蚀样缺损。