流式细胞术分析及应用课件.ppt

1、1流式细胞术分析及应用2u流式细胞术的原理u流式细胞术的应用u流式细胞术的数据处理u流式细胞术的样品制备主 要 内 容流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。3一、流式细胞术的原理现代流式细胞仪包括o 液流系统 聚焦细胞以供检测o 光学系统 激发和收集光信号 o 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 4液流

2、系统o 液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处5Sample Flow in Optical Cuvette6SampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min样品和鞘液流78Injector TipSheath fluid流式细胞仪的光学系统=激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。=激光波长:台式机为固定波长488nm,635nm，大型机波长谱

3、线宽包括 325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647 nm=光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。9流式细胞仪的光信号o 散射光信号o 荧光信号10111.散射光信号o前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号 细胞相对大小及其表面积。o侧向角散射（SSC,Side Scatter）入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光 FSC12FALS SensorLaser侧向角散射光SSC13FALS Sensor90LS SensorLaser散射光o

4、散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 -通常使用“散点图”来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据14散点图Dot Plot15lysed whole blood2.荧光信号=荧光素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强16Fluorochrome specification1718Compensation二、流式细胞术的应用o 细胞表型分析o 胞内蛋白的检测o 细胞周期分析o 细胞因子测定o 分选o 细胞内钙离子测量o 191.细胞表型分析202

5、12.胞内蛋白的检测223.细胞周期的检测23CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）244.细胞凋亡的检测25261、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分 2、DNA指数指数(DI)：相对：相对DNA含量含量=样品样品G0/G1细胞细胞DNA含量平均数含量平均数 标准二倍体标准二倍体DNA量的平均数量的平均数3、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、四倍体四倍体、多多倍体倍体、非整倍体非整倍体凋亡细胞的特点o 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞

6、器膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏o 凋亡细胞的凋亡细胞的FSCFSC降低，降低，SSCSSC增加。增加。o 细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，o FSCFSC增大，增大，SSCSSC也增大也增大27Annexin V AssayAnnexin V Assay2829Annexin V/PI双染双染活细胞为（活细胞为（Annexin V-/PI-）坏死细胞为（坏死细胞为（Annexin V+/PI+）凋亡细胞（凋亡细胞（Annexin V

7、+/PI-）Annexin V Assay-能够区分死亡与凋亡30315、细胞因子测定+Antigen(cytokines)Fluorescence Detector antibodyCapture beads Capture antibodyBeads32Beads Provide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different

8、 intensities33Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads,emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label,emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.34Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector

9、 AntibodiesWashAnalyze on flow cytometer35CBA Standard curves6、细胞分选36488 nm laser+-Charged PlatesCharged PlatesSingle cells sortedSingle cells sortedinto test tubesinto test tubesFALS SensorFluorescence detector37 细胞分选38三、流式细胞数的数据处理39404142434445compensation46分析软件47o 常用软件 FlowJo 48Gating49505152四、流式

10、细胞术的样品制备p 单细胞悬液，避免任何细胞沉积p 被检细胞或颗粒大小0.240ump 样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升53抗体的选择o 首选直接标记抗体o 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原o 间接标记：效果有时不太好54实验对照的设计空白对照：阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（单标）同型对照(Isotype)：使用与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时55表面分子检测样品制备o将

11、细胞样本制成单细胞悬液，注意悬液内不能有粘集，团块，尽量避免多的细胞碎片。o调整细胞浓度为5104-1105个，用PBS洗两次，用100ulPBS重悬细胞。o加入适量Fc受体阻断剂（与抗体匹配的动物的血清或IgG），4避光放置30分钟。o加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特型对照抗体，4避光放置30分钟。o用PBS洗两遍，用200ul固定液重悬细胞，上机检测。56胞内分子检测的样品制备o收集细胞，调至1106细胞/毫升。o4%固定液重悬细胞，常温或4避光放置30分钟。oPBS洗去固定液。o穿膜液重悬细胞沉淀，4避光孵育30分钟。oPBS洗两遍，加200ul穿膜液重悬细胞，常温避光放置10分钟。oPBS洗一遍，100ul穿膜液重悬细胞，加入适量内标抗体或独特型对照抗体，4避光孵育30分钟。oPBS洗两遍，用200ulPBS重悬细胞，上机检测。57谢 谢！58