流式细胞术(下)课件.pptx

1、流式细胞术之流式细胞仪的应用韦俊2013.09技术专题目录染料选择样本设置样本制备数据分析荧光染料的选择必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式（DAPI）嵌入结合（PI，EB）共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)激光谱线(nm)备注DAPI 359 461 UV A T 特异性Hoechst33342 346 460 UV A T 特异性Ho

2、echst33258 346 460 UV A T 特异性PI 536 617 488 不能进入活细胞EGFP 489 508 488/458 增强绿色荧光蛋白Ds Red 558 583 568/514/488 红色荧光蛋白FITC 494 518 488 对pH 敏感样本的设置阴性对照：作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光阈值。阳性对照：通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照：即不进行标记的细胞，用于确定待测标本的基础荧光阈值或检测方法是否成功。补偿对照：由于荧光光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照，用于补偿调节。将

3、多色标记的各荧光抗体一一进行单色标记。荧光补偿调节补偿前补偿后样本的制备单细胞悬液的制备目的分子标记样本过滤等待上机单细胞悬液单细胞悬液培养细胞的样品制备吸除培养上清液，用PBS漂洗一次将培养细胞用0.04%EDTA-2Na或0.29%胰蛋白酶消化3-7min，至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止，弃去消化液，加PBS液用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来（尽量避免产生泡沫），并移入离心管中，短时低速离心，即800-1000r/min，5min弃上清，加pH7.4的PBS液，低速短时离心，800-1000r/min离心3-5min，重复2-3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片加少许PBS液，将沉淀细

4、胞轻轻吹打均匀，加固定液或低温保存备用流式分析样本的制备单细胞悬液的制备目的分子标记：最好选用直标抗体，即抗体-荧光素，标记后用PBS洗2-3次。样本过滤等待上机：标记好的单细胞样本重悬至106个/毫升、300-500微升的总体积，再用300目的滤网过滤至5毫升流式管中等待上机。也可用1-2%的多聚甲醛等固定，24小时内上机测试。流式分选样本的制备样本制备的所有过程要在细胞培养间完成样本制备过程中所需试剂均需做无菌处理：如胰酶、抗体类需用milipore的0.2um滤器过滤，PBS等缓冲液需高压灭菌，所有器械、容器均需高压灭菌等。样本制备完毕后需用无菌PBS重悬至107108个/毫升，用400

5、目筛网（经过高压灭菌处理）过滤至5毫升无菌流式管中密封后准备上机。娇气的细胞可加入2%的血清保持细胞活性。样本收集管可采用5毫升无菌流式管、15毫升离心管、696孔板等。为了保持细胞活性，收集容器中可加入适量纯血清或完全培养基等备用。制备好的样本及收集容器密封好后最好放在冰盒上待用。数据分析参数：FS,SS,FL数据显示方式 设门分析技术参 数 说 明FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少数 据 显 示 方 式单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析单参数直方图每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分

6、布直方图(distribution histogram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数 DNA含量直方图和抗原表达直方图含量直方图和抗原表达直方图 二维散点图双色荧光标记细胞散点图双色荧光标记细胞散点图外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图等高图与密度图等高图等高图假三维图假三维图三维图三维图设 门 分 析 技 术Gate设置：指根据细胞分布图中的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。线性门线性门线性门任意门A 淋巴细胞淋巴细胞B 单核细胞单核细胞C 中性粒细胞中性粒细胞D Hepa1-6细胞细胞ABCD均为任意门均为任意门D十字门全图划分为四个象限：左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（GFP+），右下象限（LR）为X轴阳性细胞（PI+），右上象限（UR）为双阳性细胞（GFP+/PI+）。双阳性细胞（GFP+/PI+）的百分含量为：20/6765=0.3%