流式细胞术的基本原理及其应用课件.ppt

1、流式细胞术基本原理及应用流式细胞术基本原理及应用漆冬梅漆冬梅v流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytometerflow cytometer）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。台式机、临床型台式机、临床型大型机、科研型大型机、科研型v流式细胞术（流式细胞术（flow cytometryflow cytometry）利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流动室与液流系统流动室与液流系统光源与光学系统光源与光学系统信号收集与信号转换系统信号收集与信号

2、转换系统计算机与分析系统计算机与分析系统分选系统分选系统激光器激光器流动室流动室检测点检测点光电转换器件光电转换器件1.1.散色光信号散色光信号前向角散色（前向角散色（Forward ScatterForward Scatter，FSCFSC）小角散色，与细胞直径细胞直径成近似直线关系。侧向角散色（侧向角散色（Side ScatterSide Scatter，SSC SSC）90散色，与细胞内颗粒细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系。物理属性：物理属性：用来区分不用来区分不同细胞群体的基本形态同细胞群体的基本形态上的差异上的差异R1 R1 粒细胞群粒细胞群R2 R2 淋巴细胞群淋巴细胞群R3 R

3、3 单核细胞群单核细胞群 R4 R4 红细胞裂解碎片和红细胞裂解碎片和少少 量血小板量血小板图注：为外周血白细胞分群情况。图注：为外周血白细胞分群情况。由于淋巴细胞体积较小，细胞内颗粒较少，故其分布处于FSC、SSC都较小的区域，即R2区；粒细胞体积较大，细胞内颗粒较多，故其分布处于FSC、SSC最大的区域，即R1区；单核细胞体积较大，细胞内颗粒较粒细胞少，淋巴细胞多，故其分布于二者之间。2.2.荧光信号荧光信号=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光素吸收激光能量，发荧光素吸收激光能量，发生能量跃迁，产生荧光生能量跃迁，产生荧光=荧光信号被特定波长的光荧光信号被特定波长的光学元件传递

4、到信号收集器学元件传递到信号收集器中（中（PMTPMT），形成信号脉冲），形成信号脉冲。=每种颜色的荧光占用一个每种颜色的荧光占用一个特定波长的检测器，即荧特定波长的检测器，即荧光通道。光通道。化学属性化学属性荧光标记抗体与细胞结合原理模式图荧光标记抗体与细胞结合原理模式图荧光染料荧光染料激发波长激发波长/nm发射波长发射波长/nm 颜色颜色FITC488525绿色绿色PE488575橙黄色橙黄色PerCP488677深红色深红色APC633660红色红色BD LSR 四种激光器四种激光器355nm405nm488nm633nm可进行多达可进行多达1010色以色以上的多色荧光分析上的多色荧光分析v细胞表面分子v细胞内或细胞核内抗原v细胞凋亡vDNA含量检测与细胞周期的分析v细胞增殖v细胞毒的检测与分析v可溶性蛋白分子v报告基因v其它全血直接标记法全血直接标记法溶血：溶血：红细胞裂解液膜表面抗原染色：膜表面抗原染色：孵育温度、时间、对照固定与透膜：固定与透膜：固定剂、透膜剂细胞内抗原染色：细胞内抗原染色：透膜上机检测：上机检测：加入PBS 200-500l，上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4度冰箱内保存后检测。(24h内)