基因功能研究与相关技术课件.ppt

1、基因功能研究与相关技术基因功能研究与相关技术滕滕 艳艳生物工程研究所生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室发育和疾病遗传学研究室结构基因组学结构基因组学功能基因组学功能基因组学基因组分析的初级阶段，主基因组分析的初级阶段，主要任务是系统产生及分析基要任务是系统产生及分析基因及基因组结构信息。因及基因组结构信息。以以DNA序列测定为主要手段。序列测定为主要手段。以获得高精度的遗传图谱、以获得高精度的遗传图谱、物理图谱、转录图谱为最终物理图谱、转录图谱为最终目的。目的。生物信息学侧重于数据组织生物信息学侧重于数据组织和管理。和管理。基因组分析的新阶段，主基因组分析的新阶段，主要任务是系统产生及分析要

2、任务是系统产生及分析基因功能相关的信息。基因功能相关的信息。高通量、大规模的整体实高通量、大规模的整体实验手段结合计算机和统计验手段结合计算机和统计分析。分析。生物信息学侧重于寻找具生物信息学侧重于寻找具有特殊价值的数据组。有特殊价值的数据组。研究基因功能的实验体系研究基因功能的实验体系体外研究体外研究利用培养细胞所进行的研究利用培养细胞所进行的研究在动物整体水平进行的研究在动物整体水平进行的研究系统化、整体化、综合化系统化、整体化、综合化获得靶基因克隆的方法获得靶基因克隆的方法cDNA富集法（富集法（cDNA enrichment cloning）基于蛋白质序列的基于蛋白质序列的cDNA克隆

3、法克隆法（Protein-directed cloning）基于位点的基因克隆法基于位点的基因克隆法（Location-directed cloning）基于同源序列的克隆法基于同源序列的克隆法（Homology-based cloning）随机克隆法（随机克隆法（Random clone characterization）RACE（Rapid amplification of cDNA ends）从从cDNA表达文库获得表达文库获得cDNA克隆克隆PPBSTERMCScDNA1234etc1243连接连接转化和印膜转化和印膜表达载体表达载体细菌原位裂解细菌原位裂解特异抗体杂交特异抗体杂交Ab

4、-1抗体检测抗体检测分离阳性克隆，扩增分离阳性克隆，扩增获得相应的获得相应的cDNA克隆克隆基于同源序列的基于同源序列的PCR克隆法克隆法1234CONS-ACONS-B扩增总扩增总cDNA1234567Etc.克隆和转化克隆和转化1234567利用利用RACE-PCR获得全长获得全长cDNA克隆克隆5 RACE-PCRAAAAAAAn 35RT with internalAntisense primerAAAAAAAn 35terminal transferaseand dATPAAAAAAAn 35denature,anneal anchorprimer and extend3AAAA3A

5、AAAAATTTTTTAAAAAAAA TTTTTTdenature,anneal internalprimer and extendAAAAAA TTTTTTPCR with internal andAnchor primersAAAAAA TTTTTT5335基因结构和转录起始位点研究基因结构和转录起始位点研究用核酸酶用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验确定保护实验和引物延伸实验确定基因转录起始位点基因转录起始位点确定外显子和内含子结构图谱确定外显子和内含子结构图谱生物信息学研究基因结构、功能和进化生物信息学研究基因结构、功能和进化用核酸酶用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验保护实验和引物延伸

6、实验确定基因转录起始位点确定基因转录起始位点5533-32P()PloynucleotidekinaseHybridize with total RNA35AAAAA 35S1 nuclease355-S1+S1(A)Nuclease S1 Protection5533-32P()PloynucleotidekinaseHybridize with total RNAAAAAA 3553RT+dNTPs-RT+RT(B)Primer Extension Assay利用培养细胞在核酸水平研究利用培养细胞在核酸水平研究基因的表达和调控基因的表达和调控利用利用Northern杂交、原位杂交、杂交、原

7、位杂交、RT-PCR、mRNA表达差异显示技术研究基因的表达表达差异显示技术研究基因的表达模式。模式。利用报告基因和缺失突变分析鉴定基因的利用报告基因和缺失突变分析鉴定基因的调控序列。调控序列。用用 Gel retardation、DNase 足迹分析研究足迹分析研究DNA上的蛋白质结合位点。上的蛋白质结合位点。5.0 kb4.4 kb1 2 3 4 5 6 7 85.0 kb 1 2 3 4ABSmad3基因在小鼠不同胚胎期及成体各组织器官中的表达。基因在小鼠不同胚胎期及成体各组织器官中的表达。A、Northern杂交结果显示Smad3基因在小鼠胚胎期E7(lane 1)、E11(lane

8、2)、E15(lane 3)、E17(lane 4)表达。B、Northern杂交显示Smad3基因表达在小鼠各成体组织器官。1、睾丸；2、肾脏；3、骨骼肌；4、肝脏；5、肺；6、脾脏；7、脑；8、心脏Northern-blot原位杂交原位杂交E8.5lim 1利用转基因动物利用转基因动物研究基因表达研究基因表达的时空模式的时空模式Tie2 PlacZpolyA利用转基因动物研究利用转基因动物研究miRNA表达的时空模式表达的时空模式Mansfield et al:Nature Genetics,2004,36:1079利用利用cDNA array进行基因表达差异分析进行基因表达差异分析+/+

9、HBsAg/HBsAg利用无启动子报告基因表达载体利用无启动子报告基因表达载体鉴定基因的调控序列鉴定基因的调控序列reporterpAP1234连接并转染特定细胞连接并转染特定细胞reporterpAPreporterpAreporterpAreporterpA检测报告基因的活性检测报告基因的活性利用利用DNase I 足迹分析研究足迹分析研究DNA上上的蛋白质结合位点的蛋白质结合位点Partial DNase Iwithout Nuclearextractwith Nuclearextract利用培养细胞在蛋白质水平研究利用培养细胞在蛋白质水平研究基因的表达和功能基因的表达和功能利用抗体检测

10、基因的表达模式。利用抗体检测基因的表达模式。蛋白质工程是研究基因功能的有效手段。蛋白质工程是研究基因功能的有效手段。利用免疫共沉淀、噬菌体表面呈现技术、利用免疫共沉淀、噬菌体表面呈现技术、酵母双杂交系统研究蛋白质酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质间的蛋白质间的相互作用。相互作用。利用染色质免疫沉淀研究蛋白质与利用染色质免疫沉淀研究蛋白质与DNA的相互作用。的相互作用。蛋白质组学研究。蛋白质组学研究。利用抗体检测基因的表达模式利用抗体检测基因的表达模式PCNA+PCNA-SMAIntegrin 3 1BCL6+Ki67酵母双杂交系统用于鉴定酵母双杂交系统用于鉴定与特定基因产物相互作用的蛋白质与特定

11、基因产物相互作用的蛋白质Breporter genereporter geneABreporter geneAGAL4:B：DNA-binding domainA:activation domain染色质免疫沉淀（染色质免疫沉淀（ChIP）用于筛选在体内）用于筛选在体内与特定蛋白质相互作用的与特定蛋白质相互作用的DNA序列序列DNA-binding proteins are crosslinked to DNAwith formaldehyde in vivo.Isolate the chromatin.Shear DNA along withbound proteins into small

12、 fragments.Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation.Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the protein.Use PCR to amplify specific DNA sequences to see if they were precipitated with theantibody.利用转基因和基因打靶技术利用转基因和基因打靶技术在生物整体水平上研究基因在

13、在生物整体水平上研究基因在发育和疾病发生过程中的功能及其机制发育和疾病发生过程中的功能及其机制模式生物的应用已有模式生物的应用已有 100多年的历史，在生物学研究中具有不可多年的历史，在生物学研究中具有不可替代的重要作用。大多数生物学过程在长期的进化过程中是高度替代的重要作用。大多数生物学过程在长期的进化过程中是高度保守的，因此，许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都保守的，因此，许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都是类似的，模式生物也因此成为研究人类生物学过程和疾病发生是类似的，模式生物也因此成为研究人类生物学过程和疾病发生的重要工具。的重要工具。A model organism

14、is a species that is extensivelystudied to understand particular biological phen-omena,with the expectation that discoveries madein the model organism will provide insight into theworkings of other organisms.模式生物的概念模式生物的概念模式生物的基本特征模式生物的基本特征发育迅速、世代周期短，发育迅速、世代周期短，利用这些模式生物利用这些模式生物很很容易在相对较短的时间内研究基因在许多世代

15、容易在相对较短的时间内研究基因在许多世代间的遗传间的遗传。成年动物个体小。成年动物个体小。繁育能力强，繁育能力强，后代数量大，易于在实验室条件后代数量大，易于在实验室条件下维持。下维持。可操作性强。可操作性强。模式生物在生物医学研究中具有模式生物在生物医学研究中具有不可替代的重要作用不可替代的重要作用 在诺贝尔奖生理和医学奖颁布的在诺贝尔奖生理和医学奖颁布的100余年间（余年间（1901-2004），共有），共有 69个年度的获奖者工作与利用各种个年度的获奖者工作与利用各种类型的实验动物有关。最后类型的实验动物有关。最后 10个年度中有个年度中有8个年度个年度的获奖者创造性的科学发现与使用合适

16、的模式动物的获奖者创造性的科学发现与使用合适的模式动物有关。几乎所有发育生物学的重大研究成果以及越有关。几乎所有发育生物学的重大研究成果以及越来越多的重大疾病基因的发现都是先来自于对模式来越多的重大疾病基因的发现都是先来自于对模式生物的研究，再在人本身获得验证的。生物的研究，再在人本身获得验证的。小鼠是研究哺乳动物的主要模式生物小鼠是研究哺乳动物的主要模式生物具有较短世代周期的具有较短世代周期的哺乳动物。哺乳动物。组织细胞的结构和功组织细胞的结构和功能与人类相似。能与人类相似。小鼠基因组规模（小鼠基因组规模（2.5 Gb）及基因排列次序）及基因排列次序与人类（与人类（2.9 Gb）相似。）相似

17、。拥有众多近交系。拥有众多近交系。繁育能力强。繁育能力强。全基因组序列已被全基因组序列已被测定。测定。利用转基因技术和利用转基因技术和基因打靶技术可对基因打靶技术可对小鼠遗传物质进行小鼠遗传物质进行活体修饰。活体修饰。Producing Transgenic Mice by MicroinjectionMicroinjection foreignDNA into pronucleusGene ofinterestImplant eggs into pseudopregnant mouseDNA analysisPresence of transgene shown by PCR fragmen

18、t基因打靶技术基因打靶技术源于源于1987年年Lasker Award 2001Mario CapecchiMartin EvansOliver Smithies 基因打靶是一种改变细胞或者生物个体基因基因打靶是一种改变细胞或者生物个体基因结构的体内诱变方法，是在胚胎干细胞技术和同结构的体内诱变方法，是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础之上发展起来的。源重组技术基础之上发展起来的。“Capecchi,Evansand Smithies have revolutionized the studyof human health and diseases.”Lasker Fundation Pres

19、s release基因打靶基因打靶（gene targeting）：在基因组水平上定位改变细胞或生物）：在基因组水平上定位改变细胞或生物个体基因结构的实验技术。个体基因结构的实验技术。条件基因打靶条件基因打靶（conditional gene targeting）：通过同源重组和位点）：通过同源重组和位点特异性重组技术在特定细胞类型或者特定发育阶段对基因进行定位特异性重组技术在特定细胞类型或者特定发育阶段对基因进行定位修饰的实验技术。修饰的实验技术。基因敲除基因敲除（gene knockout）：又称基因剔除。通过同源重组或位点）：又称基因剔除。通过同源重组或位点特异性重组在基因组水平上改变特

20、定基因结构，特异性重组在基因组水平上改变特定基因结构，使其功能完全丧失使其功能完全丧失的实验技术。的实验技术。条件基因敲除条件基因敲除（conditional gene knockout）：又称）：又称“条件基因剔除条件基因剔除”。通过同源重组技术和位点特异性重组在特定细胞类型或者特定发育通过同源重组技术和位点特异性重组在特定细胞类型或者特定发育阶段使基因功能完全丧失的实验技术。阶段使基因功能完全丧失的实验技术。组织特异性基因敲除组织特异性基因敲除（tissue specific gene knockout）：又称）：又称“组织组织特异性基因剔除特异性基因剔除”。在特定组织细胞类型中使基因功能

21、完全丧失的在特定组织细胞类型中使基因功能完全丧失的实验技术。实验技术。基因敲入基因敲入（gene knockin）：）：通过同源重组或位点特异性重组在基通过同源重组或位点特异性重组在基因组特定位置引入外源基因的实验技术。因组特定位置引入外源基因的实验技术。基因打靶技术的基本流程基因打靶技术的基本流程体外对体外对ES 细胞遗传细胞遗传物质进行定向修饰物质进行定向修饰中靶中靶ES细胞经显微细胞经显微注射引入受体囊胚注射引入受体囊胚携带中靶携带中靶ES的囊胚的囊胚经胚胎移植引入假经胚胎移植引入假孕鼠子宫孕鼠子宫种系嵌合体的鉴定种系嵌合体的鉴定以及基因打靶小鼠以及基因打靶小鼠的表型分析的表型分析基因打

22、靶的策略基因打靶的策略基因敲除（基因敲除（ESES细胞，体细胞）细胞，体细胞）精细突变的引入精细突变的引入染色体组大片段的删除染色体组大片段的删除基因敲除的时空调控基因敲除的时空调控大规模随机基因敲除大规模随机基因敲除-基因诱捕基因诱捕大规模随机诱变研究大规模随机诱变研究-ENU-ENU诱导的点突变诱导的点突变在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶完全基因敲除完全基因敲除（Complete Knockout）1neoIREslac Z32tkPNS载体载体靶基因靶基因1231neoIREslac Z32中靶等位基因中靶等位基因G418,GANCLim1 is Re

23、quired for Head-organizer FunctionShawlot W&Behringer RR:Nature,1995,374:425在体细胞中实现基因敲除在体细胞中实现基因敲除(Gene Knockout in Somatic Cells)1neoIREs32ATG无启动子载体无启动子载体123靶基因靶基因12neoIREsPPAAAAAAAAAAA靶后靶后mRNAATGG418适合用于体细胞打靶研究的细胞系适合用于体细胞打靶研究的细胞系是所研究现象的合适系统，具有相关是所研究现象的合适系统，具有相关功能的测试方法。功能的测试方法。生长速度快，克隆效率高。生长速度快，克隆效

24、率高。具有整倍的染色体。具有整倍的染色体。非永生化的细胞必须具有足够的体外非永生化的细胞必须具有足够的体外增殖能力。增殖能力。基因打靶结合核移植技术研制遗传修饰大动物基因打靶结合核移植技术研制遗传修饰大动物外源基因外源基因体细胞体细胞基因打靶基因打靶靶基因靶基因定位修饰定位修饰核移植核移植去核卵母细胞去核卵母细胞组装的组装的“受精卵受精卵”囊胚期胚胎囊胚期胚胎受体动物子宫受体动物子宫基因打靶动物基因打靶动物刺激刺激体外培养体外培养胚胎移植胚胎移植子代动物子代动物基因型鉴定基因型鉴定McCreath KJ.,et al:Production of gene-targetedsheep by nu

25、clear transfer from cultured somatic cells.Nature,2000,405(6790):1066-1069 Lai L.,et al:Production of -1,3-Galactosyl-transferase knockout pigs by nuclear transfercloning.Science,2002,295:1089-1092精细突变的引入精细突变的引入(Introduction of Subtle Mutations)插入载体插入载体靶基因组序列靶基因组序列G418GANC染色体内重组染色体内重组突变基因的突变基因的基因组序列

26、基因组序列neotk21121221neotk12“Hit and Run”The Role of FGFR3 in Skeletal Development Deng C et al,1996,Cell,84:911Li C et al,1999,HMG,8:35Chen L at al,1999,JCI,104:1517 DwarfismMutations in FGFR3FGFR3 knockoutBone overgrowthTD mutation knockinDwarf miceSubtle mutationDwarf miceFGFR3 functions as a negati

27、veregulator for endochondralbone growth染色体组大片段的删除和重排染色体组大片段的删除和重排(Genome Engineering:Large Deletions and Rearrangements)12neohprt 3910purohprt 5靶片段的靶片段的5末端末端靶片段的靶片段的3末端末端Cre重组酶介导的删除重组酶介导的删除10hprt 5hprt 3LoxPLoxPLoxPHAT条件基因打靶技术条件基因打靶技术Conditional GeneTargeting MicePhenotype AnalysisCreTissue Specific

28、 orCre Transgenic MiceTissue Specific Gene Knockout MiceLoxP+DeletionTranslocationInversionA BB A基因敲除基因敲除 vs.条件基因敲除条件基因敲除Wild TypeConventional Gene KnockoutConditional Gene KnockoutNeurofibromas in NF1:Schwann cell origin and role of tumor environmentZhu Y et al:Science,2002,296:290-292NF1-/-NF1Flox

29、/-;Korx20-Cre胚胎期死亡胚胎期死亡神经纤维瘤神经纤维瘤Conditional mutation of ErbB2 receptor in cardiomyocytes leads to dilated cardiomyopathyOzcelik C et al:PNAS,2002,99:8880-5ErbB2-/-胚胎期死亡胚胎期死亡ErbB2Flox/-;MLC2v-Cre心肌肥厚心肌肥厚ErbB2Flox/-;MLC2v-CrecontrolSpontaneous Skin Tumor Formation in Smad4 MutantsSCC 8/14BCC 2/14SP 4

30、/14SH 4/14Yang LL et al:Cancer Res,2005,Oct.1,in pressp-ERKeIF5p-ERKERKp-p38p38p-JNKJNK+/-/-+/-/-+/-/-1 3 7 monWang J et al:Circulation Res,2005,Sep.8,Epub ahead of printSmad4基因敲除导致心肌肥厚基因敲除导致心肌肥厚Co/Co/CreCo/Co/CreControlControlControlCo/Co/Cre大规模随机基因敲除大规模随机基因敲除-基因诱捕基因诱捕(Large Scale of Random Gene Kn

31、ockout-Gene Trapping)SAgeoIREs基因诱捕载体基因诱捕载体插入位点序列插入位点序列123PmRNA1geoIREsPAAAAAAAAAAAATGG418ENU诱导点突变诱导点突变（ENU induced mutagenesis）乙烷亚硝基脲乙烷亚硝基脲 ENU可将它的乙烷基团转移到可将它的乙烷基团转移到DNA的的O或或N原子上，从而导致错配或碱基置换。在减数分裂前的精原细胞原子上，从而导致错配或碱基置换。在减数分裂前的精原细胞中突变率达到最高。单个位点突变率可达中突变率达到最高。单个位点突变率可达6-1.510-3。突变类型突变类型比比 例例A/TT/AA/TG/CG

32、/CA/TG/CC/GA/TC/GG/CT/A44%38%8%3%5%2%突变的蛋白突变的蛋白错义突变错义突变 64%拼接错误拼接错误 26%无义突变无义突变 10%ENU诱导突变的策略诱导突变的策略大规模大规模ENU诱变实验诱变实验 小规模小规模ENU诱变实验诱变实验基因驱动和表型驱动研究方法相结合的基因驱动和表型驱动研究方法相结合的ENU诱变策略诱变策略 用小鼠胚胎干细胞进行的用小鼠胚胎干细胞进行的ENU诱变实验诱变实验 ENUMutantCarrierUninformativeG0G1G2ENU诱导点突变的示意图诱导点突变的示意图Re/ReFunctional Genetic Analy

33、sisof Mouse Chromosome 11Kile BT et al:Nature,2003,425:81-5A recessive ENU mutagenesis screen that uses a balancer chromosome,inversion chromosome 11 has beenperformed.230 new recessive mouse mutationhave been found,88 of which are onchromosome 11.世界范围的大规模世界范围的大规模ENU诱变研究诱变研究实验室实验室 遗传筛选遗传筛选小鼠染色小鼠染色体组

34、区域体组区域表型筛选表型筛选英国医学研究委员会小鼠英国医学研究委员会小鼠基因组中心，基因组中心，Harwell德国德国GSF-国家环境和健康国家环境和健康研究中心，研究中心，Neuherberg美国美国Baylor医学院小鼠基医学院小鼠基因组中心，因组中心，Houston美国宾州大学美国宾州大学Jackson实实验室验室,Philadelphia美国美国Oak Ridge国家实验国家实验室，室，Oak Ridge澳大利亚医学基因组中澳大利亚医学基因组中心，心，Canberra日本日本REKEN基因组科基因组科学中心，学中心，Yokohama显性突变显性突变隐性突变隐性突变显性突变显性突变隐性突

35、变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变隐性突变显性突变显性突变隐性突变隐性突变全基因组全基因组M13全基因组全基因组全基因组全基因组M11,M4M5M7全基因组全基因组全基因组全基因组神经生物学神经生物学临床血液学、临床血液学、化学、形态异常、化学、形态异常、过敏、溶酶体过敏、溶酶体基因功能、发育、基因功能、发育、人类疾病模型人类疾病模型基因功能、基因功能、行为学行为学可见表型、免疫可见表型、免疫表型、老年表型表型、老年表型老年表型老年表型基因功能、基因功能、发育学发育学A systematic,genome-wide,phenotype-driven mutage

36、nesisprogramme for gene function studies in the mouseNolan,PM et al,Nature Genetics,2000,25:440-443MRC Mammalian Genetics Unit and Mouse Genome Centre,Harwell,UK26,000 mice were screened500 mouse mutants for a variety of phenotypes were recoveredThe rate of recovery of dominant mutations is about 2%

37、14,000 mice were screened182 mouse mutants for a variety of phenotypes were recovered9 lines for the IgE-mediated allergyGenome-wide,large-scale production of mutant mice by ENU mutagenesis(Nature Genetics,2000,25:444-447)de Angelis,MH,et al,Institutes of Experimental Genetics,Neuherberg,GermanyGeno

38、type-based screen for ENU-induced mutations in mouse embryonic stem cellsChen Y et al,Nature Genetics,2000,24:314-317,Case Western UniversityENU处理小鼠胚胎干细胞处理小鼠胚胎干细胞克隆挑选克隆挑选克隆冻存克隆冻存突变分析突变分析DHPLCSSCPMicroarrays表型分析表型分析利用转基因和同源重组技术利用转基因和同源重组技术在果蝇中实现基因打靶在果蝇中实现基因打靶FLPI-SceIFRTRong YS&Golic KG:Science,2000,

39、288:1973FRT18 bpHsp70Hsp70基因打靶技术的发展趋势基因打靶技术的发展趋势通过条件基因敲除通过条件基因敲除(conditional gene knock-out)技技术在时间和空间上对基因敲除进行调控。这种基术在时间和空间上对基因敲除进行调控。这种基于于 Cre-LoxP 系统的第二代小鼠模型可以模拟人系统的第二代小鼠模型可以模拟人类疾病相关的体细胞突变，提供了激动人心的新类疾病相关的体细胞突变，提供了激动人心的新机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发生和治疗过程中的作用及其机制生和治疗过程中的作用及其机制。满足大规模基因功能

40、研究需要的基因敲除技术。满足大规模基因功能研究需要的基因敲除技术。通过定位引入（通过定位引入（knock-in）技术在基因组上引入）技术在基因组上引入精细突变以研制精确模仿人类疾病的动物模型。精细突变以研制精确模仿人类疾病的动物模型。在小鼠之外的模式生物中实现基因打靶。在小鼠之外的模式生物中实现基因打靶。Knockout Mouse ProjectKnockout Mouse ProjectKOMPNature,2004,431:988-993Nature,2004,Dec 2中靶胚胎干细胞的筛选中靶胚胎干细胞的筛选ES细胞的培养：细胞的培养：必须在培养过程中维持其正常必须在培养过程中维持其正

41、常核型，核型，并保证其植入受体囊胚后高效形成功能并保证其植入受体囊胚后高效形成功能性生殖细胞的能力。性生殖细胞的能力。ES细胞品系细胞品系培养条件培养条件（器皿、培养基、缓冲液、滋养层细胞）（器皿、培养基、缓冲液、滋养层细胞）传代和冻存传代和冻存中靶胚胎干细胞的筛选：中靶胚胎干细胞的筛选：PCR，Southern杂交杂交小鼠胚胎干细胞的分离和鉴定小鼠胚胎干细胞的分离和鉴定 基因打靶小鼠建立的经典流程图基因打靶小鼠建立的经典流程图超排处理的雌鼠超排处理的雌鼠 种鼠种鼠采集采集E3.5E3.5囊胚囊胚囊胚的显微注射囊胚的显微注射正常雌鼠正常雌鼠假孕母鼠（白）假孕母鼠（白）结扎雄鼠结扎雄鼠胚胎移植胚

42、胎移植嵌合体小鼠嵌合体小鼠（棕（棕/黑）黑）棕色子代小鼠棕色子代小鼠基因型鉴定基因型鉴定野生型小鼠（黑）野生型小鼠（黑）基因打靶基因打靶杂合子小鼠杂合子小鼠打靶载体设计引起的问题打靶载体设计引起的问题不完全剔除不完全剔除其他基因编码区或者调控元件的删除其他基因编码区或者调控元件的删除筛选标记基因对表型的影响筛选标记基因对表型的影响基因打靶研究中应注意的问题基因打靶研究中应注意的问题表型解释中存在的问题表型解释中存在的问题基因冗余和代偿机制基因冗余和代偿机制遗传背景对小鼠表型的影响遗传背景对小鼠表型的影响修饰基因对表型的影响修饰基因对表型的影响亚效等位基因亚效等位基因转基因和基因打靶技术的应用前

43、景转基因和基因打靶技术的应用前景促进对基因功能的深入研究促进对基因功能的深入研究研制人类疾病的动物模型研制人类疾病的动物模型改良动物品系和研制动物反应器改良动物品系和研制动物反应器 Tumor stem cells杀死肿瘤杀死肿瘤干细胞的干细胞的药物药物杀死肿瘤，杀死肿瘤，而非肿瘤而非肿瘤干细胞的干细胞的药物药物肿瘤消退肿瘤消退肿瘤缩小，肿瘤缩小，但会重新但会重新长大长大小鼠疾病模型是进行药物筛选和小鼠疾病模型是进行药物筛选和治疗方案评价的良好模型治疗方案评价的良好模型传统的药物筛选多使用体外模型，不能完全传统的药物筛选多使用体外模型，不能完全代表多细胞生物正常的生理状态。代表多细胞生物正常的生理状态。使用小鼠疾病模型有助于筛选到在动物使用小鼠疾病模型有助于筛选到在动物体内具有生物学活性的有效成分。体内具有生物学活性的有效成分。研究基因功能的实验体系研究基因功能的实验体系体外研究体外研究利用培养细胞所进行的研究利用培养细胞所进行的研究在动物整体水平进行的研究在动物整体水平进行的研究相关的科学问题？相关的科学问题？谢谢谢谢大大家家！Thanks!Thanks for Your Attention!