基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究课件.ppt

1、基于基于1313C C稳定性同位素稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究息综合分析的发酵过程优化研究A Powerful Tool in Metabolic Engineering微观代谢流研究的重要性微观代谢流研究的重要性GenomeTranscriptomeProteomeFluxomeCellEnviromeOsmolaritypHToxin/DangerPressureCO2OxygenSheer StressORPTemperatureNutritionmetabolismAmino acidsVitaminEnzymesBio-fuelsA

2、ntibioticsPeptidesOrganic acids 其理论基础是中间代谢物的拟稳态假设拟稳态假设和物料的质量守恒定律质量守恒定律。它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后计算得出整个代谢网络的流量分布。ABCABCNN基于化学计量学的代谢通量分析（基于化学计量学的代谢通量分析（MFA）局限性局限性n 能量平衡分析上，全面确定与能量相关的反应非常困难n 原核生物中存在大量无效循环n 细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应及并行反应中的

3、净通量13C代谢通量分析代谢通量分析 典型的应用是在连续培养连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用菌体蛋白原氨基酸的标记信息，对中心代谢途径通量进行计算。对数生长期和连续培养的拟稳态过程13C同位素标记代谢原理同位素标记代谢原理衍生物 ALA M-15M-85 F-302细胞代谢物标记信息的测定方法细胞代谢物标记信息的测定方法建立氨基酸与相应的中心代谢途径中间物之间的碳原子映射矩阵对应关系由测得的氨基酸的标记丰度分布信息推算出对应的中间代谢物的碳原子标记信息RatioExperimentPEP from PPP pathwayUOAA from PEPUOAA from glyoxylateUP

4、yruvate from malate UPEP from OAAUSerine from glycineUGlycine from serineUErythrose-4-P from pentose-5-PUPentose-5-P from glucose-6-PUPentose-5-P from erythrose-4-PUSerine through glycolysis1Pyruvate through ED pathway1由计算得到的对应中间代谢物的碳原子标记信息，进而计算出代谢流经各个途径的反应速率通量。细胞代谢途径通量计算细胞代谢途径通量计算13C标记代谢技术的应用标记代谢技术

5、的应用1 发酵生产中底物（糖、前体等）消耗底物（糖、前体等）消耗较大造成发酵原材料成本较高，如青霉素、头孢、环孢菌素、维生素、7-ADCA发酵等。2 发酵生产过程中副产物的组分生产过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。3 发酵产物合成途径的分析，初级代谢与次级代谢启动初级代谢与次级代谢启动之 间的关系，干扰素的合成，免疫抑制剂。4 生产菌株工程菌生产菌株工程菌改造的基础分析，表型与基因型之间的关系的阐明，更好地指导工程菌构建。7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用Scenarios and calculationsexternalfeedfe

6、ed by13C1-alafeed byU-13C1-alacalculateratiosfrom MS 对生产菌代谢途径的变化分析。标记底物的选择。标记底物 模式的选择。数据的处理及分析。研究技术的成熟研究技术的成熟发酵过程中非稳态代谢流分析发酵过程中非稳态代谢流分析标标记记底底物物菌菌体体蛋蛋白白氨氨基基酸酸分分解解合合成成代代谢谢中中间间代代谢谢物物标标记记底底物物菌菌体体蛋蛋白白氨氨基基酸酸分分解解合合成成代代谢谢中中间间代代谢谢物物水水解解质质谱谱分分析析水水解解质质谱谱分分析析质质谱谱分分析析 细细胞胞（传传统统实实验验模模式式）（新新实实验验模模式式）离心洗涤 快速取样 灭活 细

7、胞破碎 质谱测定在线电极信号线在线电极信号线在线参数采集线尾气质谱仪数据采集分析系统GC-MS生产规模反应器微型传感反应器CHHCOO-+H3NCHCOO-+H3NCHOHHCHHCOO-+H3NCH3CH3CH3CHCOO-+H3NCH2CH2SCH3(U-13C)GlucoseOAA3PGABiomassC CO O2 2C CH H3 3N NH H3 3BiomassSerineGlycineMethionineBetaine93.456.55基于基于13CMFA的的VB12发酵过程甜菜碱发酵过程甜菜碱的代谢及工艺优化的代谢及工艺优化补补加加甜甜菜菜碱碱O OU UR R a an n

8、d d C CE ER R (m mm mo ol l/l l/h h)p pH H转转速速O OU UR RC CE ER Rp pH HA A基于非稳态标记实验的基于非稳态标记实验的CO2对对VB12合成影响的研究合成影响的研究Citratea-Ketoglutarate Succinyl-CoAOxaloacetateSuccateAcetyl-CoAPyruvatePhosphoenolpyruvate3-P-glycerateG-3-PFructose-6-PGlucoseGlucose-6-PSerineGlycine-ALAVitamin B12GlutamateNADHNAD+

9、FADHFAD+TCA cycleC1 metabolismPPP pathwayAnaplerosisVitamin B12 biosynthesisEntner-Doudoroff pathway2-Keto-3-deoxy -6-gluconateNADPHPentose-5-PSedtohepulose-7-PErythrose -4-PNADP+100.071.928.071.926.73.69.698.277.6100.887.5103.99.658.70.100.00.21.976.32148.358.76.3(1.1)6.257.661.32.6347.361.42.87.60

10、.612.50.320.43.526.17.610.10.8ThreonineAcetaldehyde1.4mmol/100mmol(glucose)ACitratea-Ketoglutarate Succinyl-CoAOxaloacetateSuccateAcetyl-CoAPyruvatePhosphoenolpyruvate3-P-glycerateG-3-PFructose-6-PGlucoseGlucose-6-PSerineGlycine-ALAVitamin B12GlutamateNADHNAD+FADHFAD+TCA cycleC1 metabolismPPP pathwa

11、yAnaplerosisVitamin B12 biosynthesisEntner-Doudoroff pathway2-Keto-3-deoxy -6-gluconateNADPHPentose-5-PSedtohepulose-7-PErythrose -4-PNADP+100.090.49.690.411.22.23.6150.1147.0151.7101.6104.13.6121.50.334.29.84.9138.251.388.2121.53.57.2117.9126.5502.6208.58.73.5mmol/100mmol(glucose)outout3.54.7AspBet

12、aine9.27.86.2BFlux ratesDistribution of total pool(mean%SD)Point APoint BPEP from PP Pathway35.9 1.915.7 1.7SER from GLY33.3 2.652.0 0.9GLY from SER81.8 0.727.6 1.5PYR from MAL1.5 2.6-0.8 0.9OAA from PYR44.4 1.944.8 2.2PEP from OAA35.9 1.219.8 1.6System for study of the CO2 on vitamin B12fermentationFig.Effect of CO2 concentration on vitamin B12 fermentation技术研究及应用的发展技术研究及应用的发展