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类型HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题解析课件.ppt

  • 上传人(卖家):晟晟文业
  • 文档编号:4099075
  • 上传时间:2022-11-10
  • 格式:PPT
  • 页数:42
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    关 键  词:
    HPLC 安捷伦 高效 使用 维护 常见问题 解析 课件
    资源描述:

    1、 HPLC HPLC的使用、维护及方法学的建立的使用、维护及方法学的建立药剂教研室药剂教研室 马冬冬马冬冬2HPLCHPLC基本原理和特点基本原理和特点液相色谱仪器部件液相色谱仪器部件实验操作与应用实验操作与应用日常维护日常维护方法学的建立方法学的建立基本原理和特点基本原理和特点基本原理:溶于流动相基本原理:溶于流动相(mobile phase)(mobile phase)中的各组分经过固定中的各组分经过固定相时,由于与固定相相时,由于与固定相(stationary phase)(stationary phase)发生作用发生作用(吸附吸附,分分配配,离子吸引离子吸引,排阻排阻,亲和亲和)的大

    2、小的大小,强弱不同强弱不同,在固定相中在固定相中滞留时间不同滞留时间不同,从而先后从固定相中流出从而先后从固定相中流出。特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。HPLCHPLC的分类的分类按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(如正已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。反相色谱法反相色谱法:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓

    3、冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂,极性物质先出极性物质先出。高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 溶剂溶剂 色谱泵自动进样器 HPLC色谱柱色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图液相色谱流程图一些商品化仪器一些商品化仪器脱气装置四元泵柱温箱样品盘检测器流动相溶剂溶剂棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程 l开启开启HP

    4、LC系统各个设备的电源系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源,打开计算机启动“1260联机工作站”,待工作站图形颜色为绿色表明仪器已就绪。l排气泡排气泡打开排气阀,将流速调至5ml/min,排气5min;待流速降为0,拧紧排气阀。l80%甲醇(过滤、超声甲醇(过滤、超声15min)冲洗系统)冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min,流速为1ml/min,待基线平稳即可进行下一步操作。注意:注意:观察柱压是否稳定,若不稳定出现大幅度柱压下降现象,很有可能是系统发生漏液,优先排查色谱柱的连接处是否漏液,其次是排气阀处,最后是观察其他管道连接处;若流动相中含有离子,80%甲醇冲洗

    5、系统之后,使用10%甲醇继续冲洗系统至少30min。否则,会有离子析出,堵塞管路。柱压应小于10bar,如若过大,应更换溶剂出口过滤白头启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程 l流动相冲洗系统流动相冲洗系统流动相配制后,先使用过滤装置过滤,然后超声15min,排除气泡干扰。流速1ml/min,使用流动相冲洗系统至少30min,待基线平稳即可进行下一步操作。l进样测定进样测定具体操作如下:点击“序列”-“序列表”-输入相关信息确定(样品瓶、样品名称、方法名称-TEST、进样次数、进样量)-“开始序列”。待进样结束后,进行下一步操作。注意:注意:在进样前,最好用100%甲醇进行洗针,以防进样

    6、针中残留的其它样品影响实验结果。水相走A、D泵,有机相走B、C泵,可防止缓冲盐析出启动液相色谱仪器的流启动液相色谱仪器的流程程 l80%80%甲醇冲洗系统甲醇冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min,流速为1ml/min,待基线平稳,将流速降为0,即可进行下一步操作。注意:若流动相中含有离子,先使用10%甲醇冲洗系统至少30min,后使用80%甲醇冲洗系统。l关闭系统关闭系统点击工作站右下角“关闭”按钮,待仪器显示未就绪,关闭1260(联机),关闭电脑,关闭液相各模块电源。拔掉总电源即结束。流动相的选择流动相的选择n甲醇甲醇n质子化溶剂 氢键供给者 n洗脱能力较乙腈弱n粘度较乙腈高n

    7、低紫外波长下有吸收n乙腈乙腈n非质子化溶剂 氢键接受者 n洗脱能力较甲醇强n粘度较甲醇低n低紫外波长下透光性好常用溶剂的极性及截止波长常用溶剂的极性及截止波长反相液相色谱,若希望出峰时间早,可以增加流动相中有机相的比例;若希望出峰时间晚,可以增加流动相中水相比例(有机相一般不低于5%)。甲醇的极限波长为210 nm,因此,检测波长较小时,应该选用乙腈而非甲醇;样品稀释最好选用流动相,可以避免溶剂峰的干扰。溶剂溶剂 水水甲醇甲醇乙醇乙醇异丙醇异丙醇乙腈乙腈四氢呋喃四氢呋喃极性常数极性常数1.000.950.880.820.650.57截止波长截止波长170210210210190210流动相的选

    8、择流动相的选择80%甲醇冲系统基线不平为了得到较好的分离效果,可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂,如三乙胺来调节峰形变“瘦”,减少拖尾现象。加入缓冲盐,调节流动相的pH值或离子强度,以改变组分的保留时间达到分离效果等。一般情况下,大家如要建立色谱条件,应先去查询中国药典及文献资料,再进行适当的修改。流动相的调节流动相的调节 过滤:过滤:0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。的缓冲液。注意:不同的试剂分别过滤,过滤后再混合;滤膜的选择,不要混用

    9、;要现用现处理,尤其是水和缓冲液脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响:气泡对测定的影响:泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积柱中气泡使流动相绕流,峰变形柱中气泡使流动相绕流,峰变形检测器中的气泡产生基线波动检测器中的气泡产生基线波动 流动相的处理流动相的处理流动相的保存流动相的保存l有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存l缓冲盐流动相:当日现配现用:低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长l有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:低温密封保存 防止有机相的挥发梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱是

    10、指在一个分析周期中,按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成(如溶剂的极性、离子强度、pH值等)和配比,使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析复杂混合物特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。优点:改善峰形,提高柱效 缩短分析时间 强保留成分不易残留在柱上缺点:会引起基线漂移 有时重现性差 故需严格控制梯度洗脱的实验条件。能等度洗脱绝不能等度洗脱绝不选择梯度洗脱选择梯度洗脱维护流程图维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器进样器检测器检查溶剂过滤器检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色查看过滤器是否变色临时取下过滤器,检查柱前压力是否正常临时取下过滤器,检查柱前压力是否正常

    11、清洁溶剂过滤器清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有浓硝酸浓硝酸 (3535)的烧杯里浸一小时,不要使用超声波清洗用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器,将过滤器重新装好。建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶,每三个月至少清洗一次。日常维护日常维护日常维护日常维护严重污染的溶剂出口过滤芯严重污染的溶剂出口过滤芯日常维护日常维护溶剂出口过滤白头溶剂出口过滤白头日常维护日常维护泵的保养:泵的保养:使用流动相尽量要清洁;进液处的砂芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡;每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染;灯的保养:灯的保养

    12、:在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器柱的保养:柱的保养:柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;使用预柱,保护柱堵了,异丙醇超声清洗保护柱柱芯即可;当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气;要注意流动相的脱气;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要提纯;进样样品要提纯;严格控制进样量;严格控制进样量;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后

    13、,都要用适当的溶剂来清洗柱;每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;(用20%甲醇溶液清洗10个柱体积,保存在90%的甲醇溶液中)日常维护日常维护HPLCHPLC分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证目的目的:证明采用的方法适合于相应检测的要求。方法验证是实验室针对特定方法的研究过程,通过设计方案,有步骤、系统地收集、处理实验数据,最终形成文件,以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。验证内容:专属性、线性范围、灵敏度(检测限、定量限)、准

    14、确度、精密度(重复性、中间精密度、重现性)、耐用性分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证专属性专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下,采用的方法能正确测定出被测物的特性。线性线性系指在设计的范围内,测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度(一般对照品稀释成7个浓度,每个浓度进样3次,计算其线性方程和相关系数,其值不应低于0.99)。范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性,测试方法适用的高低限浓度或量的区间(区间(原料药和制剂含量测定,范围应为测试浓度的80%120%)。分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证灵敏度是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音的比值灵敏度

    15、是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音的比值(S/NS/N)检测限(检测限(LODLOD):):S/N=24S/N=24定量限(定量限(LOQLOQ):):S/N=810S/N=810好的信噪比有利于:好的信噪比有利于:更好的色谱峰确认更好的色谱峰确认更好的定量更好的定量更好地完成色谱峰纯度更好地完成色谱峰纯度/均一性均一性6:1NS分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证准确度准确度:用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度,一般用回收率(%)表示。1、原料药含量测定:回收率(%)=测得量/加入量100%-空白基质中加入药品2、制剂的含量测定:标准加样回收-已知浓度样品中加入药品 数据要求

    16、:在规定范围内,至少用9个测定结果进行评价。例如,设计3个不同浓度,每个浓度各分别制备3份供试品溶液,进行测定。分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证绝对回收率=提取回收率/(1基质效应),HPLC中基质效应为01.绝对回收率绝对回收率=提取回收率提取回收率=萃取回收率萃取回收率,是用药品加血浆经萃取处理后的进样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值,一般来说,该比值不可能超过100%,能做到80%就不错了。以前国家对绝对提取率还有些要求,现在随着lc-ms的应用,最低定量限已经能做到很低,也就不需要再对绝对回收率提具体要求,只要相对回收率满意就可以。-生物样品:用于筛选提取溶剂,可以低但

    17、要稳定2.相对回收率相对回收率=方法学回收率方法学回收率,是血浆处理后的进样峰面积代入血浆标准曲线,计算所得浓度除以真实血样浓度.该比值在100%左右.一般要求高、中浓度点在15%以内,低浓度点可适当放宽。-内标的相对回收率值与绝对回收率要求类似(1)举例:10ngA药加入1ml空白血浆(10ng/ml),经萃取处理后用0.5ml流动相复溶,进样所得峰面积8000;配制对照溶液(浓度10ng/0.5ml=20ng/ml),进样所得峰面积假设为10000.那么萃取回收率为8000/10000=80%.(2)举例:上述经萃取处理的血浆溶液(10ng/ml)峰面积8000,代入标准曲线计算,假如计算

    18、所得浓度为8.5ng/ml,相对回收率则为8.5/10=85%.分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证精密度精密度:在规定的测试条件下,同一个均匀供试品,经多次取样测定所得结果之间的接近程度,一般用SD、RSD表示。1、重复性:在较短的时间间隔内,在相同的操作条件下,由同一分析人员连续测定所得结果的精密度,也就是日内(批内)精密度(日内(批内)精密度(RSDRSD限度:生物制品限度:生物制品5 5,药品药品2 2)2、中间精密度:同一实验室不同时间不同分析人员用不同设备测定所得结果之间的精密度。其中,由同一分析人员用同一设备在不同时间测定所得结果通常称为日间(批间)精密度日间(批间)精密度(

    19、RSD(RSD限度限度:生物制品生物制品1515,药品,药品5 5)3、重现性:不同实验室不同分析人员测定结果之间的精密度(基本不做基本不做)制备3个不同浓度的样品,每个浓度各3份 (对照品)100%水平的供试品溶液,至少测定6次的结果进行评价分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时,测定结果不受影响的承受程度,为使方法可用于常规检验提供依据。典型的变动因素有:被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等;液相色谱法中典型的变动因素有:流动相的组成和pH 值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。稳定性考察稳定性考察:取同一份供试品溶液,分别于不同时

    20、间进样测定(如0、2、4、6、8、10、12、24h)。注意:注意:大多文献中所提及的重复性考察并不在验证范围内,但较为常用重复性考察重复性考察:取同一批号供试品,按供试品溶液制备方法制备 6 份供试液,进行含量测定。分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证HPLCHPLC故障诊断故障诊断HPLC灵敏度不够:灵敏度不够:1样品量不足,增加样品量2样品未从柱子流出,可根据样品理化性质改变流动相或柱子3样品与检测器不匹配,可根据样品理化性质调整波长或改换检测器4检测池中有气泡,排气5流动相流量不合适,调整流速即可在一定范围内,柱温越高或流速越大,峰高越大,峰宽越小,峰面积不变,在一定范围内,柱温越

    21、高或流速越大,峰高越大,峰宽越小,峰面积不变,保留时间变小(不适于热不稳定样品)。保留时间变小(不适于热不稳定样品)。常用柱温:常用柱温:25、30 常用流速:常用流速:1 ml/minHPLCHPLC故障诊断故障诊断系统压力过高。系统压力过高。1首先拧开排液阀,以纯水作流动相并设流速为5ml/min若压力超过10bar,应先更换排液阀的虑芯。2若排液阀的虑芯没有堵塞,卸下色谱柱,然后用一两通代替色谱柱,以水作流动相设流速为1ml/min。通常压力不会超过20bar,否则系统可能有堵塞。3若上述的压力超过20bar,我们可按照从后到前的原则,也就是说先卸下进流动池的连接管接头,开泵后,若压力正

    22、常则流动池堵塞若仍不正常可将这段管另一端也卸下,开泵后再观察压力情况。同样道理,我们就可以找到堵塞的地方。容易堵塞的地方:流动池入口管;自动进样器的针及针座;柱温箱容易堵塞的地方:流动池入口管;自动进样器的针及针座;柱温箱HPLCHPLC故障诊断故障诊断系统压力过低,不稳定或没液流。系统压力过低,不稳定或没液流。1首先拧开排液阀,设流速首先拧开排液阀,设流速12ml/min后开泵,观察有无液流,若后开泵,观察有无液流,若有再仔细观察液流是否有倒吸现象如不能确定可用量筒测量流有再仔细观察液流是否有倒吸现象如不能确定可用量筒测量流速的准确性。速的准确性。2如上述无液流,或流速不准多数为主动阀阀芯或

    23、主动阀故障,如上述无液流,或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障,或泵有严重漏液。或泵有严重漏液。3怎样是大致判断主动阀抑或其阀芯故障?可用以下方法:当泵怎样是大致判断主动阀抑或其阀芯故障?可用以下方法:当泵运转时用手指轻捏主动主体,正常的主动阀能感到有节奏的脉运转时用手指轻捏主动主体,正常的主动阀能感到有节奏的脉动,如果没有,动,如果没有,主动阀有问题。如果有则可以将主动阀阀芯取主动阀有问题。如果有则可以将主动阀阀芯取出进行超声波清洗,如仍有问题,可更换阀芯。出进行超声波清洗,如仍有问题,可更换阀芯。注意,千万不注意,千万不要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀。要把整个主动阀放入超声

    24、波清洗这样会损坏主动阀。4若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定,请仔细检查有无若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定,请仔细检查有无漏液。漏液。(通常漏液地方:各接口包括色谱柱,泵,进样阀等通常漏液地方:各接口包括色谱柱,泵,进样阀等)。HPLCHPLC故障诊断故障诊断保留时间不稳定。保留时间不稳定。首先观察保留时间是否有规律的变化,并同时观察压力是否稳定首先观察保留时间是否有规律的变化,并同时观察压力是否稳定 若压力稳定而保留时间呈有规律变化,若压力稳定而保留时间呈有规律变化,多数是色谱柱未平衡好,多数是色谱柱未平衡好,特别是含有盐的流动相,需较长的时间去平衡。特别是含有盐的流动相,需较长

    25、的时间去平衡。若压力稳定而保留时间无规律变化,若压力稳定而保留时间无规律变化,请检查溶剂过滤头及真空腔请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间,如仍然不佳,可更换一色是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间,如仍然不佳,可更换一色谱柱。谱柱。若压力不稳定,若压力不稳定,请检查造成压力不稳定的因素,如:漏液,排液请检查造成压力不稳定的因素,如:漏液,排液时间不足够,盐浓度过高导致盐析,主动阀比例阀内漏,等。时间不足够,盐浓度过高导致盐析,主动阀比例阀内漏,等。HPLCHPLC故障诊断故障诊断峰面积重现性不好。峰面积重现性不好。首先观察压力是否稳定,以及观察峰面积变化是否有规律。首先观察压

    26、力是否稳定,以及观察峰面积变化是否有规律。若压力不稳定,若压力不稳定,请检查造成压力不稳定的因素,如:漏液,排液时请检查造成压力不稳定的因素,如:漏液,排液时间不足够,盐浓度过高导致盐析,主动阀比例阀内漏,等。间不足够,盐浓度过高导致盐析,主动阀比例阀内漏,等。若压力稳定但峰面积呈无规律变化,若压力稳定但峰面积呈无规律变化,请检查样品是否足够,确认样请检查样品是否足够,确认样品的稳定性,必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。品的稳定性,必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。若压力稳定且若压力稳定且峰面积呈规律变化,峰面积呈规律变化,多数为色谱柱未平衡好。多数为色谱柱未平衡好。双峰:进样量过

    27、大?预柱有气泡?-纯甲醇超声拖尾峰:流动相中添加三乙胺等减尾剂峰展宽:流动相粘度过高?:流动相粘度过高?-提高柱温提高柱温峰前延:柱温低HPLCHPLC故障诊断故障诊断基线不稳定。基线不稳定。基线漂移:基线漂移:色谱柱未平衡好,柱温未稳定,流动相变化等。色谱柱未平衡好,柱温未稳定,流动相变化等。基线噪音:基线噪音:可能原因是:流动池有气泡,流动可能原因是:流动池有气泡,流动 池被污染,对紫外检测器可将流动池被污染,对紫外检测器可将流动池移走即可确认。池移走即可确认。色谱柱和或系统受污染。色谱柱和或系统受污染。灯能量不足。灯能量不足。外界因素影响,如电源,温度和湿度,震动,等。外界因素影响,如电

    28、源,温度和湿度,震动,等。HPLC常用技巧常用技巧后运行命令:后运行命令:序列-序列参数-后序列命令/宏-stand by扣除空白:扣除空白:1260(脱机)数据分析-调用试剂数据图谱-文件-扣除空白-调用空白数据图谱-确认即完成扣除空白须知:已手动积分图谱无法扣除手动、自动积分图谱,自动积分图谱可以扣除手动积分图谱HPLC常用技巧常用技巧工作站打不开解决方案:工作站打不开解决方案:1、右键单击计算机右键单击计算机-管理管理-服务与应用服务与应用-服务,禁用服务,禁用Windows Presentation Foundation Font Cache 3.0.0这个服务;这个服务;2、将将Fo

    29、ntCache3.0.0.0.dat这个文件在这个文件在C:WindowsServiceProfilesLocalServiceAppDataLocal这个路径这个路径剪切掉,将这个文件备份到安全的地方;剪切掉,将这个文件备份到安全的地方;3、在任务管理器中结束、在任务管理器中结束presentationfontcache.exe这个程序。这个程序。41Agilent 技术支持服务流程技术支持服务流程售后电话售后电话:400-820-3278液相工程师电话:液相工程师电话:13386850383保修保修(48小时小时)维修合同维修合同(48小时小时)收费收费判断故障判断故障解决解决85%的问题的问题指定工程师现场解决指定工程师现场解决无法解决无法解决,升级处理升级处理OK跟踪解决时间跟踪解决时间满意满意谢谢大家!谢谢大家!

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