HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题解析课件.ppt
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1、 HPLC HPLC的使用、维护及方法学的建立的使用、维护及方法学的建立药剂教研室药剂教研室 马冬冬马冬冬2HPLCHPLC基本原理和特点基本原理和特点液相色谱仪器部件液相色谱仪器部件实验操作与应用实验操作与应用日常维护日常维护方法学的建立方法学的建立基本原理和特点基本原理和特点基本原理:溶于流动相基本原理:溶于流动相(mobile phase)(mobile phase)中的各组分经过固定中的各组分经过固定相时,由于与固定相相时,由于与固定相(stationary phase)(stationary phase)发生作用发生作用(吸附吸附,分分配配,离子吸引离子吸引,排阻排阻,亲和亲和)的大
2、小的大小,强弱不同强弱不同,在固定相中在固定相中滞留时间不同滞留时间不同,从而先后从固定相中流出从而先后从固定相中流出。特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。HPLCHPLC的分类的分类按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(如正已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。反相色谱法反相色谱法:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓
3、冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂,极性物质先出极性物质先出。高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 溶剂溶剂 色谱泵自动进样器 HPLC色谱柱色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图液相色谱流程图一些商品化仪器一些商品化仪器脱气装置四元泵柱温箱样品盘检测器流动相溶剂溶剂棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程 l开启开启HP
4、LC系统各个设备的电源系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源,打开计算机启动“1260联机工作站”,待工作站图形颜色为绿色表明仪器已就绪。l排气泡排气泡打开排气阀,将流速调至5ml/min,排气5min;待流速降为0,拧紧排气阀。l80%甲醇(过滤、超声甲醇(过滤、超声15min)冲洗系统)冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min,流速为1ml/min,待基线平稳即可进行下一步操作。注意:注意:观察柱压是否稳定,若不稳定出现大幅度柱压下降现象,很有可能是系统发生漏液,优先排查色谱柱的连接处是否漏液,其次是排气阀处,最后是观察其他管道连接处;若流动相中含有离子,80%甲醇冲洗
5、系统之后,使用10%甲醇继续冲洗系统至少30min。否则,会有离子析出,堵塞管路。柱压应小于10bar,如若过大,应更换溶剂出口过滤白头启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程 l流动相冲洗系统流动相冲洗系统流动相配制后,先使用过滤装置过滤,然后超声15min,排除气泡干扰。流速1ml/min,使用流动相冲洗系统至少30min,待基线平稳即可进行下一步操作。l进样测定进样测定具体操作如下:点击“序列”-“序列表”-输入相关信息确定(样品瓶、样品名称、方法名称-TEST、进样次数、进样量)-“开始序列”。待进样结束后,进行下一步操作。注意:注意:在进样前,最好用100%甲醇进行洗针,以防进样
6、针中残留的其它样品影响实验结果。水相走A、D泵,有机相走B、C泵,可防止缓冲盐析出启动液相色谱仪器的流启动液相色谱仪器的流程程 l80%80%甲醇冲洗系统甲醇冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min,流速为1ml/min,待基线平稳,将流速降为0,即可进行下一步操作。注意:若流动相中含有离子,先使用10%甲醇冲洗系统至少30min,后使用80%甲醇冲洗系统。l关闭系统关闭系统点击工作站右下角“关闭”按钮,待仪器显示未就绪,关闭1260(联机),关闭电脑,关闭液相各模块电源。拔掉总电源即结束。流动相的选择流动相的选择n甲醇甲醇n质子化溶剂 氢键供给者 n洗脱能力较乙腈弱n粘度较乙腈高n
7、低紫外波长下有吸收n乙腈乙腈n非质子化溶剂 氢键接受者 n洗脱能力较甲醇强n粘度较甲醇低n低紫外波长下透光性好常用溶剂的极性及截止波长常用溶剂的极性及截止波长反相液相色谱,若希望出峰时间早,可以增加流动相中有机相的比例;若希望出峰时间晚,可以增加流动相中水相比例(有机相一般不低于5%)。甲醇的极限波长为210 nm,因此,检测波长较小时,应该选用乙腈而非甲醇;样品稀释最好选用流动相,可以避免溶剂峰的干扰。溶剂溶剂 水水甲醇甲醇乙醇乙醇异丙醇异丙醇乙腈乙腈四氢呋喃四氢呋喃极性常数极性常数1.000.950.880.820.650.57截止波长截止波长170210210210190210流动相的选
8、择流动相的选择80%甲醇冲系统基线不平为了得到较好的分离效果,可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂,如三乙胺来调节峰形变“瘦”,减少拖尾现象。加入缓冲盐,调节流动相的pH值或离子强度,以改变组分的保留时间达到分离效果等。一般情况下,大家如要建立色谱条件,应先去查询中国药典及文献资料,再进行适当的修改。流动相的调节流动相的调节 过滤:过滤:0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。的缓冲液。注意:不同的试剂分别过滤,过滤后再混合;滤膜的选择,不要混用
9、;要现用现处理,尤其是水和缓冲液脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响:气泡对测定的影响:泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积柱中气泡使流动相绕流,峰变形柱中气泡使流动相绕流,峰变形检测器中的气泡产生基线波动检测器中的气泡产生基线波动 流动相的处理流动相的处理流动相的保存流动相的保存l有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存l缓冲盐流动相:当日现配现用:低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长l有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:低温密封保存 防止有机相的挥发梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱是
10、指在一个分析周期中,按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成(如溶剂的极性、离子强度、pH值等)和配比,使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析复杂混合物特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。优点:改善峰形,提高柱效 缩短分析时间 强保留成分不易残留在柱上缺点:会引起基线漂移 有时重现性差 故需严格控制梯度洗脱的实验条件。能等度洗脱绝不能等度洗脱绝不选择梯度洗脱选择梯度洗脱维护流程图维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器进样器检测器检查溶剂过滤器检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色查看过滤器是否变色临时取下过滤器,检查柱前压力是否正常临时取下过滤器,检查柱前压力是否正常
11、清洁溶剂过滤器清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有浓硝酸浓硝酸 (3535)的烧杯里浸一小时,不要使用超声波清洗用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器,将过滤器重新装好。建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶,每三个月至少清洗一次。日常维护日常维护日常维护日常维护严重污染的溶剂出口过滤芯严重污染的溶剂出口过滤芯日常维护日常维护溶剂出口过滤白头溶剂出口过滤白头日常维护日常维护泵的保养:泵的保养:使用流动相尽量要清洁;进液处的砂芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡;每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染;灯的保养:灯的保养
12、:在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器柱的保养:柱的保养:柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;使用预柱,保护柱堵了,异丙醇超声清洗保护柱柱芯即可;当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气;要注意流动相的脱气;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要提纯;进样样品要提纯;严格控制进样量;严格控制进样量;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后
13、,都要用适当的溶剂来清洗柱;每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;(用20%甲醇溶液清洗10个柱体积,保存在90%的甲醇溶液中)日常维护日常维护HPLCHPLC分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证目的目的:证明采用的方法适合于相应检测的要求。方法验证是实验室针对特定方法的研究过程,通过设计方案,有步骤、系统地收集、处理实验数据,最终形成文件,以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。验证内容:专属性、线性范围、灵敏度(检测限、定量限)、准
14、确度、精密度(重复性、中间精密度、重现性)、耐用性分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证专属性专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下,采用的方法能正确测定出被测物的特性。线性线性系指在设计的范围内,测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度(一般对照品稀释成7个浓度,每个浓度进样3次,计算其线性方程和相关系数,其值不应低于0.99)。范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性,测试方法适用的高低限浓度或量的区间(区间(原料药和制剂含量测定,范围应为测试浓度的80%120%)。分析方法的建立及验证分析方法的建立及验证灵敏度是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音的比值灵敏度
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