灭活剂、保护剂和免疫佐剂-共64张课件.ppt
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- 灭活剂 保护 免疫佐剂 64 课件
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1、 第三章第三章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂灭活剂、保护剂和免疫佐剂 第一节第一节 灭活剂灭活剂 缩水甘油醛缩水甘油醛甲醛溶液:甲醛溶液:规程(规程(2000)中的)中的26种灭活疫苗种灭活疫苗 灭活机理:灭活机理:灭活浓度:多数为灭活浓度:多数为0.10.10.30.3 灭活原则:低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的;灭活原则:低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的;必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠,以中断其反应。必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠,以中断其反应。氨基氨基 甲基胺甲基胺 羧基羧基 亚甲基二醇单酯亚甲基二醇单酯 巯基巯基 亚甲基二醇亚甲基二醇 甲醛甲醛 醛基醛基 羟基羟基 羟基甲酚羟基甲酚
2、烷化剂(烷化剂(alkylating agent)乙酰基乙烯亚胺(乙酰基乙烯亚胺(AEI)、二乙烯亚胺、二乙烯亚胺(BEI)、缩水甘油醛、缩水甘油醛灭活机制:灭活机制:1.烷化烷化DNA分子中的分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤鸟嘌呤或腺嘌呤等,引起单链断裂等,引起单链断裂或双螺旋链交联,因改变或双螺旋链交联,因改变DNA的结构而破坏其功能,的结构而破坏其功能,妨碍妨碍RNA的合成,的合成,从而抑制细胞的有丝分裂。从而抑制细胞的有丝分裂。2.与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。优点:优点:能破坏病毒的核酸芯髓,使病毒完全丧失感染力,而能破坏病毒的核酸芯髓,使病毒完全
3、丧失感染力,而 不损害其蛋白衣壳,保留其保护性抗原。不损害其蛋白衣壳,保留其保护性抗原。1、乙酰基乙烯亚胺(、乙酰基乙烯亚胺(N-acetyl ethylenimine,AEI)淡黄色澄明液体,有轻微氨臭味,能与水或醇任意混合。淡黄色澄明液体,有轻微氨臭味,能与水或醇任意混合。04可保存可保存1年,在年,在-20可保存可保存2年年AEI功能基团是乙烯亚胺基,可用于口蹄疫灭活苗。功能基团是乙烯亚胺基,可用于口蹄疫灭活苗。口蹄疫病毒液口蹄疫病毒液:终浓度终浓度0.05,308h,加加2硫代硫酸钠阻断硫代硫酸钠阻断2、二乙烯亚胺(、二乙烯亚胺(binary ethylenimine,BEI)市购商品
4、为市购商品为0.2的的BEI溶液,在溶液,在04可保存可保存1个月个月;终浓度终浓度0.02%,加入加入2硫代硫酸钠中断灭活。硫代硫酸钠中断灭活。3、缩水甘油醛(、缩水甘油醛(glycidaldchyde,GDA)大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。本品易挥发,水溶液含量为本品易挥发,水溶液含量为1531mg/ml。04 3个月含量渐下降,约半年失效;个月含量渐下降,约半年失效;20只能保存只能保存10d。4、-丙酰内酯(丙酰内酯(propiolactone)又名羟基丙酸)又名羟基丙酸-内酯内酯无色有刺激气味的液体,水溶液应密封于玻璃瓶中
5、无色有刺激气味的液体,水溶液应密封于玻璃瓶中5保存保存水中溶解度水中溶解度37,能与丙酮、醚和氯仿任意混合,能与丙酮、醚和氯仿任意混合对皮肤、粘膜及眼有强刺激性,对动物有致癌性。对皮肤、粘膜及眼有强刺激性,对动物有致癌性。病毒灭活后,能保持良好的免疫原性病毒灭活后,能保持良好的免疫原性主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。(stabilizer)保护剂(protector)的分类)的分类分类:分类:(根据其作用机理)根据其作用机理)渗透剂:如二甲基亚砜(渗透剂:如二甲基亚砜(DMSO)、甘油和蔗糖等)、甘油和蔗糖等非渗透剂:如聚乙烯吡咯啶酮非渗透剂:如聚乙烯吡咯啶酮(PV
6、P)和蛋白质等和蛋白质等(根据其分子量大小)(根据其分子量大小)高分子物质、低分子物质。高分子物质、低分子物质。(按其化学性质)(按其化学性质)复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物 复合物复合物 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类糖类 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类盐类 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类醇类 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等山梨醇、甘油、
7、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类酸类 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等等一些常用的冷冻干燥保护剂一些常用的冷冻干燥保护剂 分 类 保 护 剂 疫苗冻干保护剂组成疫苗冻干保护剂组成1.营养液:营养液:可修复因冻干而受损的细胞,使冻干制品含有一定量水分;可修复因冻干而受损的细胞,使冻干制品含有一定量水分;可促进高分子物质形成骨架,使冻干制品呈多孔的海绵状,可促进高分子物质形成骨架,使冻干制品呈多孔的海绵状,增加溶解度增加溶解度2.赋形剂:赋形剂:防止低分子物质的碳化和氧化,保护活性物质不受加热影响防
8、止低分子物质的碳化和氧化,保护活性物质不受加热影响 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物,增加溶解度使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物,增加溶解度3.抗氧化剂:抗氧化剂:抑制冻干制品中的酶作用,增加生物活性物质在冻干后贮存抑制冻干制品中的酶作用,增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性,如维生素期间的稳定性,如维生素C、维生素、维生素E和硫代硫酸钠等。和硫代硫酸钠等。防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤;物活性物质的损伤;降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶,以保降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水
9、结晶,以保 持细胞的活力;持细胞的活力;保护或提供细胞复苏所需的营养物质,有利于生活力的复保护或提供细胞复苏所需的营养物质,有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。苏和迅速修复自身。冻干保护剂作用机制冻干保护剂作用机制(二)病毒的保护剂(二)病毒的保护剂15%蔗糖(乳糖)脱脂乳保护剂蔗糖(乳糖)脱脂乳保护剂 蔗糖(或乳糖)蔗糖(或乳糖)5g,加脱脂乳至,加脱脂乳至100ml,充分溶解后,充分溶解后,110116高压灭菌高压灭菌3040 min。2明胶蔗糖保护剂明胶蔗糖保护剂明胶明胶2%3%(g/m1)、蔗糖)、蔗糖5%(g/m1)、硫脲)、硫脲 1%2%(g/m1)。先)。先将将12%18%明胶液
10、、明胶液、30%蔗糖液和蔗糖液和6%12%硫脲液加热溶解,硫脲液加热溶解,116高压高压灭菌灭菌3040min;3 3SPGA保护剂保护剂 兽医生物制品常用的保护剂兽医生物制品常用的保护剂蔗糖蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠、谷氨酸钠0.83g、牛血清、牛血清白蛋白白蛋白10g、加去离子水至、加去离子水至1000ml,混合溶解,过滤除菌。,混合溶解,过滤除菌。一、佐剂概念与作用机理一、佐剂概念与作用机理1.佐剂(新概念)佐剂(新概念):凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物:凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。质称为佐剂。佐
11、剂(旧概念)佐剂(旧概念):当一种物质先于抗原或与抗原混合或同当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内,时注射于动物体内,能非特异性地改变或增强机体对该抗能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质发挥其辅佐作用的物质.以前作为佐剂使用时没有免疫原性,但现在有所改变,如以前作为佐剂使用时没有免疫原性,但现在有所改变,如IL-2是佐剂和是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样一类细胞因子佐剂却不一样,具有免疫调具有免疫调节和免疫增强作用节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。单独使用时却具有免疫原性。注意注意:佐剂和免疫增强剂的关系佐剂
12、和免疫增强剂的关系?有时佐剂也是免疫增强剂有时佐剂也是免疫增强剂.作用特点:作用特点:明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生 特异性免疫应答。特异性免疫应答。用最少的抗原和最少的接种次数,产生足用最少的抗原和最少的接种次数,产生足 够的免疫应答。够的免疫应答。免疫佐剂作用机理免疫佐剂作用机理 改变正常免疫机能,吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原;改变正常免疫机能,吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原;改变抗原的构型,使抗原物质降解,并加强其免疫原性;改变抗原的构型,使抗原物质降解,并加强其免疫原性;延长抗原在组织内的贮存时间,使抗原缓慢降解和缓释,延长抗原在组织内的贮存时间,使
13、抗原缓慢降解和缓释,并发挥免疫系统的细胞间协同作用(巨噬细胞与并发挥免疫系统的细胞间协同作用(巨噬细胞与T细胞,细胞,T细胞与细胞与B细胞)。细胞)。作用方式作用方式 抗原递呈(抗原递呈(antigen presentation)抗原寻的(抗原寻的(antigen targeting)免疫调节(免疫调节(immune modulation)作用机理作用机理抗原递呈:抗原递呈:指抗原分子递呈给指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用,有细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用,有助于抗原性物质在胞内被加工,被助于抗原性物质在胞内被加工,被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递分子特异性的结合、保护
14、、运输并递呈给效应细胞。呈给效应细胞。抗原寻的(抗原寻的(antigen targeting)指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。与细胞受体的结合等有重要作用。免疫调节(免疫调节(immune modulation)是指任何可以修饰的免疫效应细是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制,可以改变特异性免疫应答胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制,可以改变特异性免疫应答的本质或强度。
15、的本质或强度。T细胞有细胞有Th1和和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此,通过筛选特定的佐剂,可以达到诱导正确能够引起不同的免疫反应。因此,通过筛选特定的佐剂,可以达到诱导正确的免疫应答的目的。的免疫应答的目的。1.1.按佐剂物理性质按佐剂物理性质 颗粒型佐剂颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂非颗粒型佐剂2.2.按佐剂的生物学性质(即按佐剂的生物学性质(即Ballanti分类法)分类法)微生物及其组分微生物及其组分 非微生物物质非微生物物质3.3.按佐剂在体内存留的时间按佐剂在体内存留的时间 贮存型佐剂(贮存型佐剂(depot ty
16、pe adjuvant)非贮存型(非贮存型(non-depot type adjuvant)佐剂的分类佐剂的分类(一)颗粒性佐剂(一)颗粒性佐剂1盐类佐剂盐类佐剂 氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。2油水乳剂佐剂油水乳剂佐剂 弗氏完全佐剂(弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant,FCA)、弗)、弗 氏不完全佐剂(氏不完全佐剂(FIA)和矿物油白油佐剂。)和矿物油白油佐剂。3免疫刺激复合物佐剂(免疫刺激复合物佐剂(ISCOM)4蜂胶佐剂(蜂胶佐剂(propolis)5脂质体佐剂(脂质体佐剂(liposomes)。)。6其他:其他:MF59佐剂、微囊
17、化佐剂(佐剂、微囊化佐剂(micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐剂和硬脂酰酪氨酸佐剂和菊粉菊粉等。等。(二)非颗粒性佐剂(二)非颗粒性佐剂1肽类佐剂(peptides):胞壁酰二肽(MDP)及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。2表面活性分子类佐剂:海藻糖合成衍生物(TDM)3核酸及其衍生物类佐剂:合成核苷酸聚合体、CpG 4含硫复合物类佐剂:左旋咪唑5碳水化合物高分子类佐剂:香菇多糖、DEAE-葡聚糖6细胞因子类佐剂(cytokine):IL-2、IL-4和-IFN等。7脂质分子类佐剂:脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素8其他:霍乱毒素(CT)、百日咳毒素
18、(PT)和破伤风类 毒素(TT)等;脂磷壁酸(LTA);维生素B12等。合成方法:(1)用铝粉加烧碱合成法 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O(2)用明矾加碳酸钠合成法 2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2(3)用三氯化铝与氢氧化钠合成 A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl 氢氧化铝胶氢氧化铝胶(铝胶)铝胶)用铝粉加烧碱合成法:用铝粉加烧碱合成法:2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)3
19、18H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用铜纱筛滤过,用布袋脱水过夜,收存于容器内,可约得600kg铝胶。取氢氧化铝干粉5055kg,加入6万毫升沸水中,搅拌均匀;倒入硫酸100kg,爆沸至棕褐色,经3060min后,加温水,边加边搅拌约至总量为35万毫升;用前加水稀释至100万毫升,温度约为80,盛装在一个缸内另一缸盛80kg烧碱,加水至100万毫升,加温至75两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内,蒸汽吹沸熟化10min,调节pH 6.9土0.1,继续熟化3min,稳定pH 6.9土0.1静置沉淀,弃上清后加入约5倍量软化水,搅拌洗涤、弃上
20、清,如此35次,检查至硫酸盐合格为止。氢氧化铝吸附力较强,所以要用软化水或去离子水洗涤。氢氧化铝胶为两性化合物,过酸或过碱都会失去胶态。故要 掌握好化合时的pH值。贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中,严密封盖,贮放期 不超过3个月。铝胶室温保存,以免破坏胶态。注意事项注意事项是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用,使抗原在注射部位保持稳定,为抗原在淋巴系统中转运提供载体,增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低,直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。一种好的乳剂疫苗应是油包水(W/O)或水包油(O/W)型,粘度低,颗粒均匀,稳定性
21、良好,呈乳白色。“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒,混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相(内相),承受分散相的液体称连续相(外相),两相间的界面活性物质称为乳化剂。油乳佐剂油乳佐剂乳化剂乳化剂1.天然乳化剂:阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳2.人工合成乳化剂3.离子型 阴离子类乳化剂:十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝 阳离子类乳化剂:氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基非离子型:月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、司本-80、吐温-80白油佐剂白油佐剂国内外常用白油:Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7号或10号白油质量标准:无色无味 50运
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