第14章色谱技术课件.ppt

1、2022-11-101概述概述v1.21.2特点：特点：（1 1）纯化倍数高纯化倍数高（2 2）操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难（3 3）终产品纯化终产品纯化（4 4）适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品2022-11-1021.3色谱的分类色谱的分类1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同机理不同的分类凝胶色谱亲和色谱离子交换色谱分离法吸附色谱法分配色谱法2022-11-1032.2.根据固定相的形状不同的分类：根据固定相的形状不同的分类：柱色谱法柱色谱法薄层色谱法薄层色谱法2022-11-1043 3 根据流动相的物态不同的分类根据流动相的物态不同的分类：液相色谱（LC）：L

2、LC、LSC反相色谱：固定相极性小于流动相4 4 根据流动相与固定相的极性分类根据流动相与固定相的极性分类 ：正相色谱：固定相极性大于流动相气相色谱（GC）：GLC、GSC2022-11-105任何色谱分离过程实任何色谱分离过程实质上都是质上都是溶质随流动溶质随流动相流动而迁移的过程相流动而迁移的过程，不同溶质在流动相不同溶质在流动相和固定相中的分配比和固定相中的分配比例不同，例不同，因而随流动因而随流动相迁移的速度不同，相迁移的速度不同，从而使不同物质分离从而使不同物质分离开来。开来。2022-11-106溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值cqKd2022-11-107

3、迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fR2022-11-1082.2色谱图及基本概念v（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或信号时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。色谱流出曲线。v（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。v（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测

4、器）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。形。v（4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。v拖尾峰、前伸峰拖尾峰、前伸峰2022-11-109洗脱曲线返回返回2022-11-10102022-11-1011（6）保留值保留值2022-11-1012 (7)(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。峰底宽度平均值之比。峰宽（峰宽（W W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，）：两侧拐点处所作的切线与峰底

5、相交于两点，此两点的距离。此两点的距离。（见图见图）半高峰宽（半高峰宽（W W1/21/2)：1/21/2峰高处的峰宽。峰高处的峰宽。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰面积：峰与峰底之间的面积。峰面积：峰与峰底之间的面积。标准偏差（标准偏差（）：）：0.607h0.607h峰高处的峰宽的峰高处的峰宽的1/21/2区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4W=4 2/)12(12WWttRRRR1完全分离2022-11-1013流动相与固定相平均浓度流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高达传质平衡时的一段柱高（22/1)(54

6、.5WtNR2)(16bRWtN NLH 2022-11-10142022-11-1015 Pharmacia KTA Pharmacia KTA 层析系统层析系统 2022-11-1016调糊调糊预装一定量的溶剂或缓冲液预装一定量的溶剂或缓冲液连续加入悬胶液连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降排除空气排除空气检查均匀度检查均匀度4.4.色谱分离操作色谱分离操作（1）装柱与平衡）装柱与平衡2022-11-1017（2）上样（吸附）v样品处理：样品处理：v(1(1）溶解）溶解vA.A.调整浓度调整浓度vB.B.盐盐vC.pH C.pH v(2)(2)过滤：除去不溶物过滤：除

7、去不溶物v流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定v上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量2022-11-1018（3）淋洗v盐浓度盐浓度vpH pH v表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)v淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定定v防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质2022-11-1019（4）洗脱方法v按操作方式按操作方式va a 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)vb b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage

8、elution)vc c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution)(gradient elution)按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specific elutionspecific elution）非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution）添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇,NaCNS,NaCNS、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积2022-11-1020（5）清洗与再生v弱酸：弱酸：HAcHAcv碱：氨水碱：氨水v促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS1-3M KCNS，6-

9、8 M 6-8 M 尿素，尿素，6 M6 M盐酸胍盐酸胍v极性溶剂：极性溶剂：20%20%乙醇乙醇v表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80-80v缓冲液平衡缓冲液平衡2022-11-1021v离子交换色谱离子交换色谱v凝胶过滤凝胶过滤v吸附色谱吸附色谱v亲和色谱亲和色谱v分配色谱分配色谱v疏水作用层析疏水作用层析2022-11-1022（1 1）离子交换色谱）离子交换色谱2022-11-1023常用的离子交换剂常用的离子交换剂2022-11-1024离子交换柱层析操作离子交换柱层析操作v树脂的选择树脂的选择v树脂的预处理及转型树脂的预处理及转型v装柱及平衡装柱及平衡（要保持均匀、无气泡和断层）

10、（要保持均匀、无气泡和断层）首先加入首先加入1/3h的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，如特定所需要的条件，如特定pH、离子强度等。、离子强度等。上样上样：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部 洗涤与洗脱：洗涤与洗脱：改变改变pH或离子强度或离子强度 收集与检测收集与检测2022-11-1025Elution(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8

11、104080120160200240Na ClProtein怛定洗脱怛定洗脱 2022-11-1026Volume(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.400.20.40.60.804080120160200240NaClProtein分步洗脱分步洗脱 2022-11-1027Volume(ml)Protein（mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240ProteinNaCl(c)(c)梯度洗脱梯度洗脱2022-11-1028（2）凝胶过滤）凝

12、胶过滤原理：原理：凝胶过滤所用的基质具有凝胶过滤所用的基质具有立体网状结构立体网状结构，筛孔直筛孔直径一致，且呈珠径一致，且呈珠装颗粒物质，这种物质装颗粒物质，这种物质可以完全或部可以完全或部分排阻分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由扩散和渗透。些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由扩散和渗透。因此，混合物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，因此，混合物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，从而被分离。从而被分离。流出顺序：流出顺序：大分子大分子中等分子中等分子小分子小分子2022-11-10292022-11-

13、10302022-11-1031v分配系数分配系数va.a.公式公式vb.b.大小排阻程度（大小排阻程度（0 0100%)100%)vVt(Vt(床体积）床体积）rr2 2h h 外水体积（外水体积（V V0 0）+内水体积（内水体积（V Vi i）+颗粒实际占有体积颗粒实际占有体积(Vg)(Vg)(i)(i)完全排阻组分完全排阻组分 KavKav0 Ve0 VeV0V0（iiii）部分排阻组分）部分排阻组分 KavKav（0-10-1）（iiiiii）完全进入胶孔组分）完全进入胶孔组分 KavKav1 Ve1 VeVtVt00VVVVKavte2022-11-1032凝胶过滤介质凝胶过滤介质

14、v葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadexsephadex）由葡聚糖由葡聚糖+环氧氯丙烷交联而成环氧氯丙烷交联而成 sephadex G 10 15 25 50 75 100 200sephadex G 10 15 25 50 75 100 200v琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose）天然凝胶）天然凝胶 Sepharose 2B 4BSepharose 2B 4Bv聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（BioBioGelGel）BioBioGel p2 p4 p100Gel p2 p4 p100等（编号等（编号100100为排阻现）为排阻现）疏水性凝胶疏水性凝胶应用：分离、

15、浓缩；脱盐；测定分子量应用：分离、浓缩；脱盐；测定分子量2022-11-1033（3）吸附色谱2022-11-1034柱色谱的操作柱色谱的操作吸附剂的选择吸附剂的选择v（1 1）依据）依据a.a.比表面积大比表面积大b.b.颗粒均匀颗粒均匀c.c.稳定性强稳定性强d.d.成本低成本低e.e.分辨率高（对不同的物质有不同的解吸能力）分辨率高（对不同的物质有不同的解吸能力）如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性化合物，应选择极性较小的吸附剂化合物，应选择极性较小的吸附剂2022-11-10352022-11-1036u柱色谱的操作柱色谱的操

16、作2022-11-1037薄层吸附色谱2022-11-1038薄层吸附色谱（操作）v制板制板：硅胶：硅胶G G板，硅胶板，硅胶CMCCMC板板v点样点样：少量多次、：少量多次、D D3mm、边、边 1.52cmv展开展开：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；展完后划前沿及样品移动距离样品点；展完后划前沿及样品移动距离v检测检测：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等2022-11-1039（4）分配色谱）分配色谱2022-11-10402022-11-1041（5）亲和色谱 利用高分子化合物可以和与它们相对应的配利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的，把相应的一对配基中的一个通过物理吸的，把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或化学共价键作用，固定在载体上使它变附或化学共价键作用，固定在载体上使它变成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。基。2022-11-1042（6）正相/反相层析(6.1)根据极性a.正相色谱:流动相极性固定相极性b.反相色谱:流动相极性固定相极性(6.2)洗脱顺序a.正相色谱:极性小极性大的化合物b.反相色谱：极性大极性小的化合物