浙科版生物选修一《生物技术实践-》《DNA片段的PCR扩增》讲授课件-新版.ppt

1、 在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？1.了解PCR技术的操作原理与方法。2.进行DNA片段的PCR扩增。（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脱氧核糖含氮碱基磷酸O12345A T G C脱氧核糖 A磷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷酸O脱氧核糖 G磷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸O

2、脱氧核糖 T磷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸O脱氧核糖 C磷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷酸O 一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3和5碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3、5、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端4、多脱氧核苷酸链的形成脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3磷酸酯键OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5335多脱氧核苷酸

3、链结构简图5、DNA分子的双螺旋结构 DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为35，另一条链为53）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对5端3端5端3端OO脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3脱氧脱氧核糖核糖 碱基碱基磷酸磷酸OH3OOOODNA

4、分子双螺旋结构示意图（二）DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体4、模板DNA母链1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件酶、ATP、原料、模板边解旋边复制(过程）7、复制特点半保留复制（结果）8、遵循原则碱基互补配对原则9、精确复制的原因10、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行（三）PCR(多聚酶链式反应）1、DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸

5、DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸3、PCR原理 在80100C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器（四）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性（模板DN

6、A解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR 循环第一步：加热变性复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循环第二步：引物与靶序列退火延伸 DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循环

7、第三步：引物延伸靶序列 靶序列第1个 PCR 循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201，048，576301，073，741，8243、30次循环后靶序列扩增的数量4、PCR 循环的结果 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度序列呈指数扩增 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸（一）设备及用品1.PCR仪，或用3个恒温水浴，泡沫塑料离心管加热固定器代替 2.移液器和微量离心管 3.定时钟 4.电泳仪或电泳槽和2个9V电池 5.50ml烧杯或三角瓶 6.微波

8、炉或沸水浴 7.振荡器PCR仪微量离心管微量移液器（二）实验操作步骤1、标记好3个0.5ml微量离心管，依照课本P68表依次加入试剂，关闭上盖并在振荡器上震荡20s，使之混合均匀。2、将3个微量离心管放到固定器上，保证每管中的液面在水浴中的水面以下，依照课本P68时间表依次放入3个水浴进行PCR。有条件的可用PCR仪，将微量离心管放到PCR的管架上。3、电泳。将TBE缓冲液加入到电泳槽中，使缓冲液高出凝胶面3-4mm，再将20lDNA标准溶液与2l蓝色的缓冲液充分混匀后，加到凝胶板的加样孔中。另取3支微量离心管吗，标记管号，分别加入20lPCR产物和2l蓝色加样缓冲液。混合后分别加到3个凝胶板

9、上的小池中，然后进行电泳。如果用18V电池约进行电泳4-6h，如用直流电泳仪电源，80V电泳40min。4、电泳后将凝胶缓冲液倒出，缓冲液可再利用。将10ml染色液（亚甲蓝）覆盖在凝胶表面，15-20min后，移去染色剂，再加入5ml70乙醇，不断摇动1-2min，使乙醇分布均匀，再除去乙醇，加入冷水，几分钟后看到蓝色的区带出现，这就是扩增DNA。从图谱中也可看出12个循环和14个循环之间的扩增量的区别。PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：（三）注意事项 隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，用一次性枪头 PCR仪加热使（）变性，复性使引物与模板DNA（），延伸需将反应温度升至中温()，在（）的作用下，以（）为原料，以（）为复制的起点，合成新链。如此重复改变反应温度，经（）三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72退出