浙科版生物选修一《生物技术实践-》《乳酸脱氢酶同工酶的分离》讲授课件-新版.ppt

1、u 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。u 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。u 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究.蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？1.了解同工酶的概念，进行乳酸脱氢酶同工酶的分离。2.认识电泳法分离生物大分子的基本原理，尝试蛋白质的电泳分离。（1）概念：同工酶来源于同一个体或组织，能催化统一反应，而蛋白结构不同的酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。（2

2、）种类：乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5u 根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同PI各不相同，在同一SDS-PAGE中，在电场中移动速度不同，可用电泳法将其分离。（3）生理及临床意义：a.在代谢调节上起着重要的作用。b.用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征。c.同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。d.同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。u是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N，-亚甲基丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂N，N，N，-四甲基乙二胺（TEMED）作用下聚合交联而成的三维网

3、状结构的凝胶。uTEMED催化AP生成硫酸自由基：以AP为催化剂，以TEMED为加速剂。（1）原理：u 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：u Bis将单体长链间连成网状结构：（2）聚丙烯酰胺凝胶类型：1.连续系统：是指电泳系统采用相同孔径的凝胶缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨力不高。2.不连续系统：是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进

4、行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。不连续电泳的四个不连续性u 凝胶浓度的不连续性；u 缓冲液离子成分的不连续性；u 缓冲液PH梯度的不连续性；u 电位梯度的不连续性。（3）蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素：u电荷因素：蛋白质分子性状和大小相同，所带电荷性质和数量不同u分子大小：蛋白质分子性状和所带电荷和数量相同，分子大小不同u分子形状：蛋白质所带电荷和数量相同，分子性状不同（4）乳酸脱氢酶同工酶活性染色u 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）作

5、为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝（NBT）作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。分离胶的制备浓缩胶的制备待分离样品的处理加样电泳染色1.分离胶制备成分蒸馏水凝胶液凝胶缓冲液10APTEMED分离胶（下层）1.65ml 2.0ml1.3ml50l5l摇匀，混匀，并用蒸馏水封住胶面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。2.浓缩胶制备成分蒸馏水凝胶液凝胶缓冲液10APTEMED分离胶（下层）1.40ml 0.33ml0.25ml20l5l摇匀，混匀，将胶灌在分离胶之上，并用蒸馏水封住胶面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸

6、吸干残余水分3.制备电泳凝胶板。依组装电泳槽后，制备5ml分离胶倒入槽中。在胶的上端轻轻加入少量水，以防止生成胶的弯月面。待胶凝固后，小心倒出蒸馏水，再用滤纸吸净残留的水。将2ml浓缩胶倒入，插入数字，再加入少量水，待胶凝固后，小心倒出蒸馏水，再用滤纸吸净残留的水，拔出梳子。4.加样。取10l血清，加入等体积40蔗糖溶液，在离心管中混匀后，用移液器吸取15l样品，小心加入到凹槽中，每组一槽，组间进行比较。也可取胎牛、小牛、老牛的血清比较同工酶相对百分含量的差别。5.电泳。装配好电泳装置，打开电源将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，改为20-25mA，当溴酚蓝前沿距下框1-2cm时，将电流调

7、至0，关闭电源。6.染色。配置LDH活性染液。电泳后，取出凝胶板，放在盛有染色液的培养皿中，在37水浴上保温20-30min，可看出LDH同工酶呈现蓝紫色区带。注意事项1.封管要严，防止漏液。2.固定玻璃管要竖直。3.凝胶制备时：TEMED和AP要后加，加入后用玻璃棒缓慢匀速的混匀，避免有气泡产生。4.配胶后立即灌胶。1.随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）A.弄清各种蛋白质的空间结构B.弄清各种蛋白质的功能C.弄清各种蛋白质的合成过程D.获得高纯度的蛋白质D2.使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）A.电荷的多少 B.分子的大小C.肽链的多少 D.分子形状的差异B3.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A.相同 B.相反 C.相对 D.相向B4.缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A.温度 B.pH C.渗透压 D.氧气浓度B退出