免疫印迹法的实验技术课件.ppt

1、LOGO免疫印迹法的实验技术Western Blot 印迹方法 一、Western-Blot简介vWestern Blot，又称为免疫印迹，又称为免疫印迹Immunoblot,是是70年代末年代末80年代初开年代初开展起来的蛋白质测定技术。展起来的蛋白质测定技术。v蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治学的乔治斯塔克斯塔克George Stark。在尼。在尼尔尔伯奈特伯奈特Neal Burnette于于1981年所年所著的著的?分析生物化学分析生物化学?Analytical Biochemistry中首次被称为中首次被称为Western Blo

2、t。v印迹法印迹法blotting是指将样品转移到固相载体是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反响来检测样品的一种上，而后利用相应的探测反响来检测样品的一种方法。方法。vWestern Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。同条件下的相对含量的半定量方法。v实验主要内容：实验用途实验用途2实验注意事项实验注意事项 4实验方法及步骤实验方法及步骤3 3 实验原理实验

3、原理3 1实验原理实验原理v 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行别离 凝胶上别离到的蛋白质转移至固相支持物硝酸纤维素膜或PVDF 膜上 用抗靶蛋白的非标记抗体一抗与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合与经辣根过氧化物酶标记偶联的二抗结合 用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。vWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，被检测物是蛋白质，“探针是抗体，

4、探针是抗体，“显色用显色用标记的二抗。经过标记的二抗。经过PAGE别离的蛋白质样品，转别离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的第二抗体起反免疫反响，再与酶或同位素标记的第二抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳别离响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳别

5、离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。泛应用于检测蛋白水平的表达。实验步骤v 提取细胞或组织蛋白提取细胞或组织蛋白测定蛋白测定蛋白含量含量制备制备SDS-PAGE胶胶蛋白蛋白变性、上样变性、上样电泳电泳 转膜转膜封闭封闭一抗一抗TBST洗膜洗膜HRP标记标记的二抗的二抗TBST洗膜洗膜ECL底物显底物显色色X光片曝光、显色光片曝光、显色结果分析结果分析二、蛋白样本的制备和浓度的测定二、蛋白样本的制备和浓度的测定v蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白的提取的提取 v组织蛋白

6、提取组织蛋白提取v组织和裂解液参加蛋白酶抑制剂，为防止细胞组织和裂解液参加蛋白酶抑制剂，为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解按比例配制内蛋白酶对蛋白质的降解按比例配制-置于玻璃置于玻璃匀浆器中，充分研磨冰上操作匀浆器中，充分研磨冰上操作4离心，离心，12000rpm，10min取上清分装取上清分装1.5ml离心管离心管中中20保存。低温和蛋白酶抑制剂可以减少保存。低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。蛋白的降解。v 蛋白酶抑制剂：如蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，等，要根据具体情况具体选择。要根据具体情况具体选择。本卷须知本卷须知注意个人防护。注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏

7、膜、严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。，立即用大量水冲洗。所用离心机需提前预冷。所用离心机需提前预冷。为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定原因：原因：Western Blot作为一项半定量实验技术，作为一项半定量实验技术，电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量测定。量测定。蛋白质总量缺乏可能阻碍对目的蛋白的鉴定蛋白质总量缺乏可能阻碍对目

8、的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高那么会使带形扭曲蛋白质含量太高那么会使带形扭曲,甚至会甚至会影响此电泳方法的分辨力。影响此电泳方法的分辨力。方法：方法：目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法双缩脲法Biuret法、法、Folin酚试剂酚试剂法法Lowry法、紫外吸收法以及考马斯法、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法亮蓝法Bradford法。法。目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试剂盒法试剂盒.BCA法工作原理vBCA(bicinchoninic acid 二辛可酸二辛可酸)法测定法测定蛋白质的原理与蛋白质的原理与Low

9、ery法相似。即在碱性环境法相似。即在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将络合并将Cu2+复原成复原成Cu1+。BCA特异地与特异地与Cu1+结合结合形成稳定的紫蓝色复合物，在形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有最大处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干

10、扰物质去垢剂等影响小。物质去垢剂等影响小。SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳法。电泳法。原理原理1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。分子大小和形状以及所带电荷多少。2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，参加一定量的十二烷基硫酸在聚丙烯酰胺凝胶系统中，参加一定量的十二烷基硫酸钠钠SDS，SDS是一种阴离子外表活性剂，能使蛋白是一种阴离子外表活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键翻开，并结合到蛋白质分子上，在一定质的氢键和疏水键翻开，并结合到

11、蛋白质分子上，在一定条件下，大多数蛋白质与条件下，大多数蛋白质与SDS的结合的结合1.4gSDS/1g蛋蛋白质，使各种蛋白质白质，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。此时，蛋白而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。实验前的准备实验前的准备设备

12、和材料的准备设备和材料的准备:v电泳槽的准备电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的、电泳仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、烧杯、量筒烧杯、量筒试剂的准备和配置试剂的准备和配置:v双蒸水、双蒸水、30%丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为为8.8)、Tris-HCl(PH为为6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲、电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、蛋白液、电泳缓冲液、蛋白Markerv 根据待测样品的蛋白质分子量选择别离胶和浓缩胶的浓度根据待测样品的蛋白质分子量选择别离胶和浓

13、缩胶的浓度.一般浓缩胶为一般浓缩胶为5%，别离胶根据所测蛋白分子量定，别离胶根据所测蛋白分子量定作用作用v浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽电泳槽的上方为负极，下方为正极的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含使样品中所含SDS 多肽复合物在别离胶外表聚多肽复合物在别离胶外表聚集成一条很薄的区带或称积层集成一条很薄的区带或称积层0.5-1cm。v别

14、离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛别离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在别离胶中，以起着分子筛效应，也就是蛋白质在别离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终到达彼此分开。终到达彼此分开。(PH为为8.8)实验步骤实验步骤 组装组装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽凝胶用玻璃槽 配制和灌注别离胶配制和灌注别离胶 用水压线用水压线30-40分钟直至别离胶凝固分钟直至别离胶凝固 倒掉压线水配制和灌注浓缩胶倒掉压线水配制和灌注浓缩

15、胶 插入样品梳插入样品梳 凝胶直至浓缩胶凝固凝胶直至浓缩胶凝固 制备样品制备样品样品样品:上样缓冲液上样缓冲液=4:1,混匀混匀1000C加热加热5分分钟钟,离心取上清离心取上清)拔出样品梳拔出样品梳 参加电泳缓冲液参加电泳缓冲液,上样，电泳上样，电泳 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止夹心式垂直电泳槽夹心式垂直电泳槽蛋白变性的原因蛋白变性的原因v上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合物，按比例配制，物，按比例配制，100煮煮5min。v其目的是将其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形

16、成棒状结构蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷同时使整个蛋白带上负电荷。v 玻璃板要清洁玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。对齐卡严，防止漏胶。v 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩手套及口罩.v 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制.v 溶液中一旦参加溶液中一旦参加TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中夹槽中.v 浓缩胶缓冲液浓缩胶

17、缓冲液(PH为为6.8)、别离胶缓冲液、别离胶缓冲液(PH8.8)，PH值要准确。值要准确。v 胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,防止有气泡的产生防止有气泡的产生.v 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应参加适量的电泳上为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应参加适量的电泳上样缓冲液样缓冲液.v 正确连接电泳连线负极在上，正极在下以保证蛋白由正确连接电泳连线负极在上，正极在下以保证蛋白由上向下方向电泳。上向下方向电泳。说明：说明：不是所有的蛋白质都能用不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子

18、量是不可靠的。包括：电荷异常或构象蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质如某些糖蛋白以及一些结异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质如某些糖蛋白以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是影响，它的分子量是21,000，但，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分

19、子量，互。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。相验证。有许多蛋白质，是由亚基如血红蛋白或两条以上肽链如有许多蛋白质，是由亚基如血红蛋白或两条以上肽链如-胰凝乳胰凝乳蛋白酶组成的，它们在蛋白酶组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目更全面的

20、资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。v蛋白质印迹法就是将电泳后别离的蛋白质从凝胶蛋白质印迹法就是将电泳后别离的蛋白质从凝胶中转移到固相支持物上。中转移到固相支持物上。v常用的固相支持物有常用的固相支持物有NC 硝酸纤维素膜、尼硝酸纤维素膜、尼龙膜及龙膜及PVDF聚偏氟乙烯膜。聚偏氟乙烯膜。vPVDF聚偏二氟乙烯，其具有更好的蛋白吸聚偏二氟乙烯，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价格比格比NC膜要贵。膜要贵。NC膜更常用。膜更常用。附：附：膜的选择

21、主要根据：膜的选择主要根据：膜与目的蛋白分子的结合能力也就是单位面积的膜与目的蛋白分子的结合能力也就是单位面积的膜能结合蛋白膜能结合蛋白 的载量的载量膜的孔径也就是拦截蛋白的大小有两种规格：膜的孔径也就是拦截蛋白的大小有两种规格：和和for MW20kDa)。不影响后续的显色检测也就是适合用于所选显色不影响后续的显色检测也就是适合用于所选显色方法方法v 转膜通常有两种方法：毛转膜通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。细管印迹法和电泳印迹法。电泳印迹效率更高。这种电泳印迹效率更高。这种方法是用有孔的塑料和有方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成维素膜夹成

22、三明治三明治形状，形状，而后浸入两个平行电极中而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合以使蛋白质离开凝胶结合在膜上。转移后的膜就称在膜上。转移后的膜就称为一个印为一个印blot，用于，用于对蛋白质的进一步检测。对蛋白质的进一步检测。实验前的准备实验前的准备v设备和材料的准备设备和材料的准备:v 转移电泳槽的准备转移电泳槽的准备(本实验用垂直电本实验用垂直电泳槽泳槽)、转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海、转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海绵垫、玻璃棒绵垫、玻璃棒v试剂的准备和配置试剂的准备和配置:电转液、甲醇电转

23、液、甲醇PVDF膜、考马斯亮蓝染色液、丽春红染色膜、考马斯亮蓝染色液、丽春红染色液液v根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大小及时间小及时间.我们通常我们通常 200mA/膜，按照目的膜，按照目的蛋白蛋白分子大小、胶浓度分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。实际适当调整。目的蛋白分子大小目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度胶浓度 转移时间转移时间(h)80-140 8%1.5-2.0 25-80 10%1.5 1540 12%0.75 v NC膜预处理：剪裁与胶大小一致的膜预处理：剪裁与胶大小一致的NC膜，将

24、其浸入膜，将其浸入1转移缓冲液平衡转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证分钟以上。注意：必须保证NC膜始膜始终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，防止手上蛋终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，防止手上蛋白将膜污染。白将膜污染。v 剪裁剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时时4层海绵垫也用转移液浸泡。层海绵垫也用转移液浸泡。v 取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转移液中。移液中。v 转膜转膜v 制作制作“三明治：由夹子的黑板阴极侧开始，依次三明治：由夹子的黑板阴极侧开

25、始，依次为黑板为黑板海绵垫片海绵垫片3层滤纸层滤纸胶胶NC膜膜三层滤纸三层滤纸注意：排除气泡注意：排除气泡海绵垫片海绵垫片(阳极阳极)，扣紧转膜夹板，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中见蛋白质转移示意放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中见蛋白质转移示意图。图。v v 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜此步操作极流动。接通电源，恒压状态下转膜此步操作宜在宜在4进行。进行。v小心取出转移膜，做好标记，在小心取出转移膜，做好标记，在1TBST液中液中漂洗两次。漂洗两次。v用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白用考

26、马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全转移是否完全,用丽春红染色液膜用丽春红染色液膜,检测蛋白质是检测蛋白质是否转移到膜上否转移到膜上.vPVDF膜需膜需100%甲醇预处理，再用缓冲液平衡，甲醇预处理，再用缓冲液平衡，才能用。才能用。v必须保证必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中膜始终完全浸于转移缓冲液中,滤纸滤纸要充分浸于转移缓冲液中要充分浸于转移缓冲液中.v操作要轻，防止胶膜的破损。操作要轻，防止胶膜的破损。v记住记住“黑面胶，白面膜，夹子的黑面朝架子的黑面胶，白面膜，夹子的黑面朝架子的黑面。黑面。v必须保证必须保证“三明治各层之间均无气泡。三明治各层之间均无气泡。v电转移时最

27、好为恒流电转移时最好为恒流,电转移的时间和电流大小取电转移的时间和电流大小取决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小.分子量大分子量大,电流稍大时间长电流稍大时间长;分子量大分子量大,电流小时间短电流小时间短;v注意做好膜上的标记。注意做好膜上的标记。v转移结束后，借助抗原抗体反响，利用转移结束后，借助抗原抗体反响，利用ECL增强化学发光发光或增强化学发光发光或DAB3,3二氨基联苯胺显色技术检测目的蛋白。二氨基联苯胺显色技术检测目的蛋白。vDAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。vECL试剂采用氧化复原反响的原理：利用二

28、抗上标记的辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化复原反响，从而发出荧光。vECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可到达pg级以上)等优点，且DAB具有致癌性。v ECL结果结果 DAB结果结果 1.设备和材料的准备设备和材料的准备:洗膜用平皿洗膜用平皿 摇床摇床 ECL发光所需发光所需(避光盒、避光盒、X-光片、光片、X-光片曝光盒等光片曝光盒等)2.试剂的准备和配置试剂的准备和配置:封闭液封闭液(5%脱脂奶粉、脱脂奶粉、BSA、WesternBlot 膜封膜封闭液闭液 一抗一抗 二抗二抗 抗体稀释液抗体稀释液 TBST缓冲液缓冲液 ECL试剂盒或试剂盒或DAB试剂盒试

29、剂盒v 1、封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭、封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭1h或或4过夜；封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，使过夜；封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，使抗体只能跟特异的蛋白结合抗体只能跟特异的蛋白结合v 将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；v 将封闭后的膜放入一抗工作液中，将封闭后的膜放入一抗工作液中，4反响过夜反响过夜(或或37,2小小时时)。v 将膜从一抗中取出，将膜从一抗中取出，TBST洗涤洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗，室温下缓慢摇动洗涤。涤。v 将二抗用抗体稀释液稀释到所需

30、浓度。将二抗用抗体稀释液稀释到所需浓度。v 将膜放入二抗工作液中室温将膜放入二抗工作液中室温30min。v TBST洗涤洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗涤，室温下缓慢摇动洗涤v 6.曝光及洗片或曝光及洗片或DAB显色显色曝光及洗片方法曝光及洗片方法按按1:1v/v混合混合ECL试剂盒中两种液体。试剂盒中两种液体。将上述混合液均匀铺在将上述混合液均匀铺在NC膜外表，室温作用膜外表，室温作用2分分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC膜防止膜防止在膜的上面出现气泡。在膜的上面出现气泡。在

31、暗室中红光下将在暗室中红光下将X光胶片直接压于包裹后光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。的膜上，曝光盒中曝光适当时间。将曝光后将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂洗、光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影定影液中定影1分钟具体曝光时间及显影时间分钟具体曝光时间及显影时间需根据显影结果作出调整需根据显影结果作出调整实验本卷须知实验本卷须知1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉处理膜的过程中，切勿使膜干掉 否那么导致背否那么导致背景增高景增高2.选择适宜的一抗及二抗浓度浓度高不一定效果选择适宜的一抗及二抗浓度浓度高不一定效果好，过高会导致背景变黑好，过高会导致背景变黑 淬灭时间

32、来选择适宜的曝光时间。淬灭时间来选择适宜的曝光时间。4.保鲜膜包裹保鲜膜包裹NC膜时，防止膜上有气泡，影响显膜时，防止膜上有气泡，影响显影。影。5、显影、定影要充分，、显影、定影要充分，X平要完全浸没在液面下。平要完全浸没在液面下。？v背景太高背景太高1、膜没有均匀浸湿或出现干膜2、膜或者缓冲液污染3、封闭不充分4、抗体与封闭剂出现交叉反应5、抗体浓度过高 原原因因对对策策1 1、转膜前用转膜前用电转液电转液将膜完全将膜完全浸湿浸湿，操作过程避免干膜，操作过程避免干膜2 2、拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3 3、检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4 4、杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度LOGOAdd your company slogan