第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用课件.ppt

1、 1常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application 2第 一 节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&BlottingMolecular Hybridization&Blotting TechnologyTechnology 3核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)在在DNADNA复性过程中，如果把不

2、同复性过程中，如果把不同DNADNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNADNA与与RNARNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNADNA或或RNARNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形关系，就可以在不同的分子之间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理 4复性复性RNADNA 5（一）印渍技术（一）印渍技术 BlottingBlotting 首先由首先由Edwen SouthernEdwen Southern在在1

3、9751975年提出。年提出。BlottingBlotting即即“印渍印渍”，指将存在于凝胶中的生物，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于测分析的技术，目前广泛应用于DNADNA、RNARNA、和蛋白质的检测和蛋白质的检测 6探针技术 probeprobe将一小段已知序列的核酸片段用放射性将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为或全链进行进行标记，称为“探针探针”然然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显后用于分子杂交

4、，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来显现出来 7二、印渍技术的类别及应用二、印渍技术的类别及应用 DNADNA印迹技术印迹技术 Southern blottingSouthern blottingRNARNA印迹技术印迹技术 Northern blottingNorthern blotting蛋白质印迹技术蛋白质印迹技术 Western blotting Western blotting 斑点印迹斑点印迹 Dot blottingDot blotting原位杂交原位杂交 in situ hybridization in situ hy

5、bridization DNADNA点阵点阵 DNA array DNA array DNADNA芯片技术芯片技术 DNA chip DNA chip 8（一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 Southern blottingSouthern blotting 又称为又称为SouthernSouthern杂交，即杂交，即DNA-DNADNA-DNA杂交杂交分析分析。是研究。是研究DNADNA图谱的基本技术，主图谱的基本技术，主要用于要用于基因组基因组DNADNA的分析的分析，如在基因组，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。分析

6、重组质粒和噬菌体。在遗传诊断在遗传诊断DNADNA图谱分析及图谱分析及PCRPCR产物分析等方面有产物分析等方面有重要价值。重要价值。9基本方法基本方法将将DNADNA标本用标本用限制性内切酶限制性内切酶消化后，经消化后，经琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳分离各酶解片段；分离各酶解片段；经经碱变性碱变性，TrisTris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将将DNADNA从凝胶中从凝胶中转印转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定固定，凝胶中，凝胶中DNADNA片段的相对位置在片段的相对位置在DNADNA片段转片段转移到滤膜的过程中继续保持着。移到滤膜的过程

7、中继续保持着。附着在滤膜上的附着在滤膜上的DNADNA与与3232P P标记的探针标记的探针杂交杂交，利用，利用放射自显影术放射自显影术确定探针互补的每条确定探针互补的每条DNADNA带的位置，带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNADNA片片段的位置和大小。段的位置和大小。10Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心 11（二）（二）RNARNA印渍技术印渍技术 Northern blottingNorthern blotting又称为又称为NorthernNorthern杂交，即

8、杂交，即RNA-DNARNA-DNA杂交分析杂交分析。是一种将是一种将RNARNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNAmRNA的的表达水平表达水平以及比较不同组织和细胞的以及比较不同组织和细胞的同一基因的同一基因的表达情况表达情况。12（三）蛋白质印渍技术（三）蛋白质印渍技术Western blottingWestern blotting又称为又称为WesternWestern杂交，或杂交，或免疫印渍技术免疫印渍技术，即利用抗原即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝抗

9、体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：应用：用于检测样品中特异性蛋白质用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。等。13三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 14（一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blottin

10、g)(Northern blotting)用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。15斑点印迹斑点印迹Dot blottingDot blotting斑点杂交法是斑点杂交法是不经过电泳不经过电泳，而将被检标，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。张膜上可同时检测多

11、个样品。16原位杂交原位杂交in situ hybridizationin situ hybridization即即组织原位杂交组织原位杂交，指组织切片或细胞，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交。因此原位杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内杂交可以确定探针的互补序列在胞内的的空间位置空间位置，这一点具有重要的生物，这一点具有重要的生物学和病理学意义。学和病理学意义。17第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Ch

12、ain Reaction 18PCRPCR技术技术 polymerase chain reactionpolymerase chain reactionPCRPCR即即聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术，是指利用耐热，是指利用耐热DNADNA聚合酶的反复作用，通过变性聚合酶的反复作用，通过变性-延伸延伸-复性的循环操作，在体外迅速将复性的循环操作，在体外迅速将DNADNA模板模板扩增数百万倍的一种操作技术。扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在理论上可在2 2小时内将一个小时内将一个DNADNA分子扩增分子扩增到到10106 6-10-109 9倍，从而大大提高对其进行分析倍，从而大大提高对其进

13、行分析研究的速度。研究的速度。195 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理 20Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。21n模板模板DNADNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶n dNTPsdNTPsn Mg Mg2+2+二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分 22三、三、PCRP

14、CR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C 23四、四、PCRPCR的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆 PCRPCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA mRNA 获得已知目的基因片段；获得已知目的基因片段；利用特异性引物以利用特异性引物以cDNAcDNA或基因组或基因组DNADNA为模板，获为模板，获得已知的目的基因；得已知的目的

15、基因；利用简并引物从利用简并引物从cDNAcDNA文库文库或或基因组文库基因组文库中获得具中获得具有同源性的有同源性的DNADNA片段；片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNAcDNA文库文库或或基因组文库基因组文库中随机获中随机获得目的基因。得目的基因。24n（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。进行嵌合、缺失、点突变等改造。n（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析 由于由于PCRPCR技术具有高度敏感性，故可用技术具有高度敏感性，故可用于微量于微量DNADNA和和RNA

16、RNA的分析检测。的分析检测。n（四）（四）DNADNA序列测定序列测定n（五）基因突变分析（五）基因突变分析 25三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术 26实时实时PCRPCR技术原理技术原理 27第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 28核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert(Maxam-Gillbert法法)DNADNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger(sanger法法)29一、化学裂解法一、化学裂解

17、法(Maxam-Gilbert(Maxam-Gilbert法法)基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可

18、在X X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。30 化学裂解法的示意图化学裂解法的示意图 31二、二、DNADNA链末端合成终止法链末端合成终止法 32目目 录录 33三、三、DNADNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNADNA序序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行双脱氧核苷酸，然后进行SangerSanger测序反应，反应测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激

19、发不同大小DNADNA片段上的荧光分片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNADNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。34DNA自动测序结果举例目目 录录 35基 因 文 库Gene Library第第 四四 节节 36基因组基因组DNADNA文库文库 (genomic DNA library)(genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library)基因文库基因文库 (gene library)(gene library)是指一个包

20、含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。37基因组基因组DNA文库文库c cDNA文库文库 38第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例 39疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节 40克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)(functional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)

21、(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-(position-independent candidate gene approaches)independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional (positional candidate gene approaches)candidate gene approaches)41定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病

22、基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。得到部分纯化的遗传性疾病。42克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNAcDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选探针，筛选cDNAcDNA文库。文库。功能互补试验功能互补试验 (functional complementation assay)(functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从

23、功能学角度鉴定致病基因。43（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基因分析、基因文库的筛选与基因克隆文库的筛选与基因克隆 44（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发由于基因组作图的完成和分

24、子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。出候选致病基因。45（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。据，鉴定出候选致病基因。46第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of Heredity-The

25、 Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model Modified Animal Model 47转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术 48

26、 49 50 51核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物体细胞，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆(clone)(clone)。二、核转移技术二、核转移技术 52基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)(gene targeting)灭活，有灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术 53四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型

27、基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation)(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型 54第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip TechnologyBiological Chip Technology 55DNADNA芯片芯片(DNA chip)(DNA chip)cDNAcDNA芯片芯片(cDNA chip)(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针

28、，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)56 57DNA微阵列微阵列 58是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(protein chip)59第第

29、八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术Research Technology of Interaction of ProteinResearch Technology of Interaction of Protein 60蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相

30、互作用。等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用研究的重要性 61酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术 62一、酵母双杂交技术的基本原理 63 二、酵母双杂交系统的应用二、酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用（五）在药物设计中的应用