生化实验技术离子交换总结课件.ppt

1、生物化学实验技术生物化学实验技术 生化实验技术课安排生化实验技术课安排1、层析技术（台桂花）、层析技术（台桂花）离子交换层析分离纯化抗体（离子交换层析分离纯化抗体（2天）天）2、电泳技术（台桂花）、电泳技术（台桂花）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（可用于抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳（可用于抗体分离纯化过程的检测）（分离纯化过程的检测）（1天）天）3、免疫检测技术（王桂云）、免疫检测技术（王桂云）酶联免疫和双向免疫扩散（酶联免疫和双向免疫扩散（2天）天）4、多糖分离和鉴定技术（周义发、魏民）、多糖分离和鉴定技术（周义发、魏民）中草药多糖的分离提取和理化性质研究中草药多糖的分离提取和理化性质研究（2-4周，

2、）周，）生化实验技术课安排生化实验技术课安排时间：时间：根据实验内容和学生时间安排根据实验内容和学生时间安排实验报告：实验报告：根据实验内容确定根据实验内容确定生化实验技术课成绩评定生化实验技术课成绩评定 平时成绩：占平时成绩：占50分，包括出勤情况，课分，包括出勤情况，课堂表现（态度、动手能力和实验结果），堂表现（态度、动手能力和实验结果），实验报告等。实验报告等。期末考试：占期末考试：占50分，以口试方式，在实分，以口试方式，在实验室进行，学生按抽签，分别到指定教验室进行，学生按抽签，分别到指定教师处考试。考试内容为本课程所涉及的师处考试。考试内容为本课程所涉及的实验原理、实验设计、动手操

3、作、结果实验原理、实验设计、动手操作、结果分析、注意事项等。分析、注意事项等。层析（层析（chromatography）简介）简介纸层析纸层析 薄层层析薄层层析 柱层析柱层析气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱（常规液相（常规液相/高效液相）高效液相）凝胶过滤凝胶过滤（分子筛层析）（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析疏水作用层析疏水作用层析等等等等种类种类离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换层析离子交换层析(Ion Exchange Chromatography)：一种吸附层析技术，根据分子极性的差异而进一种吸附层析技术，根据分子极性的差异而进行分离。行分离。用途：分析和制备各种

4、极性物质（例如蛋白质、用途：分析和制备各种极性物质（例如蛋白质、核酸、多糖、及其单体和寡聚物）核酸、多糖、及其单体和寡聚物）离子交换离子交换阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换强阳离子交换强阳离子交换弱阳离子交换弱阳离子交换强阴离子交换强阴离子交换弱阴离子交换弱阴离子交换 1、种类、种类组成组成：固体支持物固体支持物(insoluble matrix)带电基团带电基团(charged groups)平衡离子平衡离子(counter-ions)2、离子交换剂、离子交换剂(Ion Exchanger)（1）固体支持物（）固体支持物（insoluble matrix)固体支持物：固体支持物：无机

5、化合物，例如羟基磷灰石无机化合物，例如羟基磷灰石合成树脂，例如聚苯乙烯二乙烯苯合成树脂，例如聚苯乙烯二乙烯苯合成高聚物，例如合成高聚物，例如MonoBeads、SOURCER多糖，例如葡聚糖、琼脂糖、纤维素多糖，例如葡聚糖、琼脂糖、纤维素固体支持物决定了以下层析性质：固体支持物决定了以下层析性质：柱效（柱效（efficiency)容量容量（capacity)回收率（回收率（recovery)化学稳定性（化学稳定性（chemical stability)机械强度（机械强度（mechanical strength)流动性（流动性（flow properties)（1）固体支持物（）固体支持物（in

6、soluble matrix)阳离子电荷基团阳离子电荷基团阴离子电荷基团阴离子电荷基团例如例如CM、SP、S例如例如DEAE、QAE、Q（阴离子交换剂）（阴离子交换剂）（阳离子交换剂）（阳离子交换剂）电荷基团以共价方式联到固体支持物上。不能通过转型改变带电基团。电荷基团以共价方式联到固体支持物上。不能通过转型改变带电基团。（2）带电基团（）带电基团（charged groups)常见带电基团的化学结构：常见带电基团的化学结构：（2）带电基团（）带电基团（charged groups)带电基团决定了离子交换层析的种类：带电基团决定了离子交换层析的种类：阳离子交换阳离子交换（强（强/弱）弱）阴离子

7、交换阴离子交换（强（强/弱）弱）带电基团决定了层析的基本性质：带电基团决定了层析的基本性质：哪种物质结合（哪种物质结合（type）结合强弱结合强弱（strength）结合多少（结合多少（capacity）（2）带电基团（）带电基团（charged groups)阴离子阴离子 阳离子阳离子 例如例如Cl-、OH-例如例如K+、Na+（阴离子交换剂）（阴离子交换剂）（阳离子交换剂）（阳离子交换剂）平衡离子与带电基团的电荷相反。靠静电引力与带电基团结合平衡离子与带电基团的电荷相反。靠静电引力与带电基团结合.结合是可逆的，可以被其它离子所取代。结合是可逆的，可以被其它离子所取代。（3）平衡离子（）平衡

8、离子（counter-ions)1 2 3 4 5 平衡离子平衡离子待分离的两种物质待分离的两种物质低盐洗脱低盐洗脱高盐洗脱高盐洗脱平衡平衡 上样和吸附上样和吸附 洗脱（弱）洗脱（弱）洗脱（强）洗脱（强）再生再生/平衡平衡3、离子交换层析过程和原理、离子交换层析过程和原理NaCl浓度浓度 01.0A 280 nm 上样上样梯度洗脱梯度洗脱洗脱体积洗脱体积 再生再生平衡平衡平衡平衡3、离子交换层析过程和原理、离子交换层析过程和原理 洗脱曲线洗脱曲线 离子交换剂离子交换剂 层析条件的选择层析条件的选择样品缓冲液和洗脱液的样品缓冲液和洗脱液的pH洗脱方式洗脱方式 流速流速平衡离子平衡离子层析柱层析柱

9、样品体积样品体积4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素蛋白质是两性电解质，蛋白质是两性电解质，pH影响其带电状态影响其带电状态4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 pH对蛋白质层析的影响对蛋白质层析的影响4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 pH对蛋白质层析的影响对蛋白质层析的影响阳离子交换层析常用缓冲液：阳离子交换层析常用缓冲液：4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 pH对蛋白质层析的影响对蛋白质层析的影响阴离子交换层析常用缓冲液：阴离子交换层析常用缓冲液：4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 pH对蛋白质层析的影响对蛋白质层析的影响 离子交换剂离子交换剂 层析条

10、件的选择层析条件的选择样品缓冲液和洗脱液的样品缓冲液和洗脱液的pH洗脱方式洗脱方式 流速流速平衡离子平衡离子层析柱层析柱样品体积样品体积4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素非梯度洗脱（非梯度洗脱（isocratic)：洗脱液不变洗脱液不变梯度洗脱梯度洗脱（gradient)：洗脱液的洗脱液的pH或盐浓度逐渐增加或盐浓度逐渐增加或降低或降低4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 洗脱方式的选择洗脱方式的选择连续梯度洗脱连续梯度洗脱不连续梯度洗脱不连续梯度洗脱4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 洗脱方式的选择洗脱方式的选择几种梯度组合几种梯度组合4、影响分离效果的因素、影响分离效

11、果的因素 洗脱方式的选择洗脱方式的选择高效液相：高效液相：泵泵A洗脱液洗脱液B泵泵B两种洗脱液，两种洗脱液，A和和B，相同，相同pH，不同盐浓度，不同盐浓度，B的盐浓度大于的盐浓度大于A,A和和B按不同比例混合，按不同比例混合，B的比例逐渐增大的比例逐渐增大 常规液相：常规液相：洗脱液洗脱液A洗脱液洗脱液B梯度混合器梯度混合器混合器混合器洗脱液洗脱液A4、影响分离效果的因素、影响分离效果的因素 连续梯度的形成连续梯度的形成1.盐析法将抗体从血清中分离：抗体可在盐析法将抗体从血清中分离：抗体可在33-50%饱和饱和度的硫酸铵中沉淀（第度的硫酸铵中沉淀（第1天）天）2.透析法除去抗体样品中的盐：透

12、析到洗脱液透析法除去抗体样品中的盐：透析到洗脱液A中（第中（第1天过夜）天过夜）3.离子交换层析法纯化抗体：在线检测并收集（第离子交换层析法纯化抗体：在线检测并收集（第2天）天）4.SDS-PAGE法检测各收集管中的抗体法检测各收集管中的抗体（第（第3天）天）本实验课内容本实验课内容兔血清中抗体的分离纯化兔血清中抗体的分离纯化离子交换剂：离子交换剂：DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱方式：盐浓度梯度洗脱（洗脱方式：盐浓度梯度洗脱（NaCl浓度从浓度从0 到到1 mol/L）洗脱液的洗脱液的pH：8.8（在此条件下，抗体带负电）（在此条件下，抗体带负电）注意：样品应透析到低盐缓

13、冲液中（即洗脱液注意：样品应透析到低盐缓冲液中（即洗脱液A），），在低盐条件下，抗体能结合，在低盐条件下，抗体能结合，在高盐条件下，抗体不能结合。在高盐条件下，抗体不能结合。离子交换层析的基本条件：离子交换层析的基本条件：NaCl浓度浓度 01.0A 280 nm 上样上样梯度洗脱梯度洗脱洗脱体积洗脱体积 洗脱过程和曲线洗脱过程和曲线平衡（基线跑平）平衡（基线跑平）洗脱过程和曲线洗脱过程和曲线101020304050607080900102030405060洗脱液体积（ml）280 nm 吸光值（相对值）-0.100.10.20.30.40.50.6NaCl浓度（mol/L）23抗体的检测抗体

14、的检测 SDS-PAGE从各收集管中取出从各收集管中取出20 l 用用SDS-PAGE 方法检测。方法检测。泳道泳道2：标准分子量蛋白：标准分子量蛋白泳道泳道3：不结合的蛋白：不结合的蛋白（峰（峰1），不含抗体蛋白），不含抗体蛋白泳道泳道4-10：结合的蛋白（峰：结合的蛋白（峰2），含抗体蛋白），含抗体蛋白泳道泳道11-15和泳道和泳道1：结合的蛋白（峰：结合的蛋白（峰3），不含抗体蛋白），不含抗体蛋白1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15IgG重链重链50kIgG轻链轻链25k101020304050607080900102030405060洗脱液体积（ml）

15、280 nm 吸光值（相对值）-0.100.10.20.30.40.50.6NaCl浓度（mol/L）23实验报告要求实验报告要求1、层析和电泳写一份实验报告。先写层析，然后写电泳。、层析和电泳写一份实验报告。先写层析，然后写电泳。层析部分包括原理及层析过程、简要操作、层析结果层析部分包括原理及层析过程、简要操作、层析结果（包括洗脱曲线并注明洗脱体积、实验条件写在洗脱曲线（包括洗脱曲线并注明洗脱体积、实验条件写在洗脱曲线的边缘）、分析实验结果。的边缘）、分析实验结果。2、思考题（选作）、思考题（选作）（1）应用那些方法能够降低样品溶液中盐的浓度，各种方）应用那些方法能够降低样品溶液中盐的浓度，各种方法的优缺点及适用范围。法的优缺点及适用范围。（2）离子交换层析与蛋白质的等电点有无关系，试分析说）离子交换层析与蛋白质的等电点有无关系，试分析说明。明。本实验注意事项本实验注意事项1.所有层析过程和样品处理要用蒸馏水，管路、试所有层析过程和样品处理要用蒸馏水，管路、试管、容器先用自来水洗干净后，再用蒸馏水冲一管、容器先用自来水洗干净后，再用蒸馏水冲一下。下。2.实验结束以后，清洗所有用过的器皿、回收凝胶、实验结束以后，清洗所有用过的器皿、回收凝胶、清洗管路、台面擦干净。清洗管路、台面擦干净。3.值日生清扫。值日生清扫。