蛋白质免疫印迹技术课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《蛋白质免疫印迹技术课件.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 免疫 印迹 技术 课件
- 资源描述:
-
1、蛋白质免疫印迹技术Ppt一、免疫学一、免疫学n研究抗原物质的结构和功能;研究抗原物质的结构和功能;n免疫应答产物的结构和功能;免疫应答产物的结构和功能;n抗原刺激机体产生免疫应答的规律。抗原刺激机体产生免疫应答的规律。n免疫学的研究范围很广,与很多相关学科交织在免疫学的研究范围很广,与很多相关学科交织在一起,并且发展成了很多学科,如免疫生物学、一起,并且发展成了很多学科,如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。n随着免疫生物学的发展,人们发现在高等动物体随着免疫生物学的发展,人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构(即免疫系统内存在着
2、具有免疫功能的组织结构(即免疫系统)。)。淋巴组织淋巴组织免疫活性细胞免疫活性细胞免疫活性介质免疫活性介质免疫系统功能的生理和病理表现免疫系统功能的生理和病理表现功能名称功能名称 生理功能生理功能 病理表现病理表现免疫防御免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应(强)超敏反应(强)免疫缺陷病(弱)免疫缺陷病(弱)免疫自稳免疫自稳 清除损伤或衰老细胞清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病自身免疫性疾病免疫监视免疫监视 清除突变或畸变细胞清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性肿瘤或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞杀伤病毒感染细胞 感染感染n当
3、外源异体物质,如细菌、病毒、蛋白质、多当外源异体物质,如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后,可以激活机体免疫系统糖等进入动物机体后,可以激活机体免疫系统,产生对外源物质的排除作用,从而保护机体,产生对外源物质的排除作用,从而保护机体免受外源物质的侵害。免受外源物质的侵害。n机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。巴细胞。n免疫应答的类型免疫应答的类型(一)固有性免疫应答(一)固有性免疫应答(innate immune response)innate immune response)又称先天性免疫应答,非特异性免疫应答:是机体又称先天性免疫应
4、答,非特异性免疫应答:是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。(二)适应性免疫应答(二)适应性免疫应答(adaptive immune responseadaptive immune response)又称获得性免疫应答,特异性免疫应答,是机体出又称获得性免疫应答,特异性免疫应答,是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。(具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性)(具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性)抗原和免疫原性抗原和免疫原性n抗原(抗原(antigensantigen
5、s,AgAg)是指能够刺激机体免疫活性细)是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞,并在体内或体外发生特胞产生抗体或致敏淋巴细胞,并在体内或体外发生特异性反应的物质。异性反应的物质。n常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。白质、核酸、激素等有机物。n抗原具有两方面的特性:免疫原性(抗原具有两方面的特性:免疫原性(immunogenicityimmunogenicity)和免疫反应性()和免疫反应性(immunoreactivityimmunoreactivity)。)。q免疫原性(免疫原性(immunog
6、enicityimmunogenicity)是指抗原刺激机体引起免疫应)是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。答的能力。q免疫反应性(免疫反应性(immunoreactivityimmunoreactivity)是指抗原与相应免疫应答)是指抗原与相应免疫应答产物产物(即抗体即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力在体内或体外发生特异性结合反应的能力。抗原的分类抗原的分类n抗原可以分为完全抗原和半抗原。抗原可以分为完全抗原和半抗原。n完全抗原:具有免疫原性和免疫反应性的抗原称完全抗原:具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原(为完全抗原(complete antigencomplete an
7、tigen)n半抗原:只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原半抗原:只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原(称为半抗原(haptenhapten),也称为不完全抗原),也称为不完全抗原(incomplete antigen)(incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。都属于半抗原。抗体的种类抗体的种类n抗体(抗体(antibodiesantibodies,Ab)Ab)是专门
8、对抗抗原特异是专门对抗抗原特异结构的球蛋白,故也称为免疫球蛋白(结构的球蛋白,故也称为免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)immunoglobulins,Ig)。存在于血清、体液中。存在于血清、体液中,是构成机体免疫作用的主要物质。,是构成机体免疫作用的主要物质。n免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同,分为五种类型:,分为五种类型:IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、IgDIgD和和IgEIgE。n人体血清中人体血清中IgGIgG含量最多,含量最多,IgAIgA次之,次之,IgMIgM较较少,少,IgDIgD和和IgEIgE微量。
9、微量。n抗原抗体反应(抗原抗体反应(antigen-antibody reactionantigen-antibody reaction)n是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内(生于体内(in vivoin vivo),也可发生于体外(),也可发生于体外(in vitroin vitro)。)。n体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用;体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用;n体外反应:可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应体外反应:可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。
10、及中和反应等各种不同的反应类型。n因抗体主要存在于血清中,在抗原或抗体的检测中多采用因抗体主要存在于血清中,在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验,所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应(血清作试验,所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应(serologic reactionserologic reaction)。)。二、印迹法(二、印迹法(blotting)n印迹法是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应印迹法是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。的探测反应来检测样品的一种方法。n19751975年,年,SouthernSouthern建立了将建立了将DNADNA
11、转移到硝酸纤维素膜(转移到硝酸纤维素膜(NCNC膜)上,并利用膜)上,并利用DNADNARNARNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNADNA片段的片段的方法,称为方法,称为Southern Southern 印迹法。印迹法。n人们用类似的方法,对人们用类似的方法,对RNARNA和蛋白质进行印迹分析,对和蛋白质进行印迹分析,对RNARNA的印迹分析称为的印迹分析称为NorthernNorthern印迹法,对单向电泳后的印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为蛋白质分子的印迹分析称为WesternWestern印迹法,对双向电印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为泳后蛋白质分子的印迹分
12、析称为EasternEastern印迹法印迹法三、蛋白免疫印三、蛋白免疫印迹迹的应用的应用n免疫印迹法免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT),亦称酶联,亦称酶联免疫电转移印斑法免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITBn是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。相结合的杂交技术。n具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。n是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用
13、的方法。方法。蛋白质免疫印迹检测技术蛋白质免疫印迹检测技术一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、实验仪器三、实验仪器四、操作步骤四、操作步骤五、实验结果与分析五、实验结果与分析六、思考题六、思考题一、实验目的一、实验目的n学习掌握动物抗血清的制备原理及技术学习掌握动物抗血清的制备原理及技术n通过实际操作学会动物抗血清的制备通过实际操作学会动物抗血清的制备n掌握掌握WesternWesternblottingblotting的基本原理的基本原理 n熟悉熟悉WesternWesternblottingblotting的实验操作的实验操作 抗原与相应抗体在浓度合适时,则形成清晰的沉淀环
14、,其直径大小与所加抗原量成正比。通过实际操作学会动物抗血清的制备将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线,然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线,计算出待测抗原的含量。然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应;为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。洗涤去除没有结合的特异性抗体后;如要获得大量的抗体,多采用大动物;效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法,此法对所有的抗体均适用。蛋白质免疫印迹技术Ppt洗涤去除没有结合的特异性抗体后;首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。单向扩射免疫法:以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合,孵育24h后,测定其结合率。2mL),贮
15、于-20以下冰箱保存。抗原是多种多样的,就其化学成分而言,有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。Westernblotting检测抗血清5mL完全佐剂混合,震荡混匀,制成油包水的形态是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。2mL),贮于-20以下冰箱保存。WesternBlot一般流程二、实验原理二、实验原理n第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制动物的常规免疫及抗血清的制备备n第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 n将适当的抗原物质注入动物体内,经过一定时间,动将适当的抗原物质注入动物体内,
16、经过一定时间,动物血清中可出现大量特异性抗体,这种含抗体的血清物血清中可出现大量特异性抗体,这种含抗体的血清称为免疫血清。称为免疫血清。n优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫原性,以及动物应答的能力。此外,尚需考虑免疫途原性,以及动物应答的能力。此外,尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。素。第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备动物的常规免疫及抗血清的制备(一)多克隆抗体的概念(一)多克隆抗体的概念n抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。抗原通常是由多个抗原决定
17、簇组成的。n由一种抗原决定簇刺激机体,由一个由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B B淋巴细胞接淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monoclone antibodyMonoclone antibody)。)。n由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。就是多克隆抗体。n机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。抗体的结构抗体的结构(二)用于免疫的动物(二)用于免疫的动物n由于动物
18、的遗传性不同,同一抗原对不同动物由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体,产生特异或同种不同品系动物、或不同个体,产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此,进行动物免免疫应答的强弱是不同的。因此,进行动物免疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。动物。n常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为般为6 6个月大小的动物。个月大小的动物。n动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。抗血清数量。q如要获得大量的抗体,多采
19、用大动物;如要获得大量的抗体,多采用大动物;q如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;q如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备抗体;抗体;q如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯系小鼠制备。系小鼠制备。n一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备,因动物反应一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清。良好,而且能够提供足够数量的血清。(三)抗原(三)抗原n抗原是多种多样的,就其化学成分
20、而言,有蛋白抗原是多种多样的,就其化学成分而言,有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。n为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原。n不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。基团、立体结构等。(四)免疫途径(四)免疫途径n免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。内、皮内、皮下、淋巴结
21、内注射等。n一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.1mL0.1mL左右。左右。n实验中实验中0.2mL0.2mL,3 34 4点注射。点注射。n皮下注射皮下注射掌握Westernblotting的基本原理(具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性)抗原与相应抗体在浓度合适时,则形成清晰的沉淀环,其直径大小与所加抗原量成正比。抗原具有两方面的特性:免疫原性(immunogenicity)和免疫反应性(immunoreactivity)。加强免疫:初级免疫后两周进行。单向扩射免疫法:以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合,孵育24h后,测定其结合率。
22、免疫防御清除病原微生物及其它抗原性异物超敏反应(强)取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉放血,也可心脏采血。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线,然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线,计算出待测抗原的含量。一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.每23周加强免疫一次。(八)抗血清质量的评价三、蛋白免疫印迹的应用不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。人体血清中IgG含量最多,IgA次之,IgM较少,IgD和IgE微量。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。免疫系统功能的生理和病理表现常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠
23、和鼠等。(1)用酒精棉球消毒待注射部位37一小时,4过夜。(五)佐剂(五)佐剂n应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性,从而提高抗体的效价。免疫原性,从而提高抗体的效价。n佐剂主要可分为两种:一种本身具有免疫佐剂主要可分为两种:一种本身具有免疫原性,如百日咳杆菌、抗酸杆菌(结核分原性,如百日咳杆菌、抗酸杆菌(结核分枝杆菌)以及革兰阴性杆菌等;另一种本枝杆菌)以及革兰阴性杆菌等;另一种本身无免疫原性,如氢氧化铝、磷酸钙、矿身无免疫原性,如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。物油乳剂、表面活性剂等。n目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。目前实践中常应用
24、的佐剂福氏佐剂。n福氏佐剂(福氏佐剂(Freund adjuvantFreund adjuvant),通常是由羊通常是由羊毛脂毛脂1 1份、石腊油份、石腊油5 5份。这是不完全福氏佐剂。份。这是不完全福氏佐剂。n在每毫升不完全佐剂加入在每毫升不完全佐剂加入1 120mg20mg卡介苗就成卡介苗就成为完全佐剂。为完全佐剂。(六)免疫方法(六)免疫方法n抗原剂量,首次剂量为抗原剂量,首次剂量为101050g50g,加强免疫的剂量,加强免疫的剂量约为首次剂量的约为首次剂量的1/41/4。n首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。时用不完
展开阅读全文