蔡锡渠—宫颈癌筛查技术HPV12+2检测课件.ppt

1、 3HPVHPV的型别的型别v 目前已发现超过200种型别的人乳头瘤病毒（HPV）。v 依据与生殖道肿瘤相关性，将HPV分为：HPV分型检测的意义分型检测的意义（1）预测受检者发病的风险度，确定最佳的治疗时期）预测受检者发病的风险度，确定最佳的治疗时期Gary M.Clifford et al;Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14(5):115764提示：不同的高危型促进LSIL（低度鳞状上皮内病变）向SCC（鳞状细胞癌）转变的能力有差异。HPV16，18 的致宫颈癌风险性大于其他高危型HPV。基线筛查细胞学阴性基线筛查细胞学阴性/高危高危HPVHP

2、V阳性的女性阳性的女性1010年内年内CIN3CIN3病变的累积发病率病变的累积发病率vKhan MJ,et al.J Natl Cancer Inst 2005;97:10721079.Follow-up time(months)Other high-risk HPV+HPV18+High-risk HPVHPV16+Cumulative incidence rate of CIN3(%)17.2%(11.522.9)HPV16+13.6%(3.623.7)HPV18+3.0%(1.94.2)其它高危型HPV阳性0.8%(0.61.1)高危型HPV阴性4.5 1527395163758799

3、119.5111020151050基线时HPV16/18阳性者相比其它12种高危HPV型别阳性者，有更高风险进展为高度宫颈病变HPV16/18HPV16/18阳性的短阳性的短期风险也明显高于其期风险也明显高于其它致癌型它致癌型HPVHPV阳性阳性v对对204204例宫颈癌患者前瞻性研究发现，例宫颈癌患者前瞻性研究发现，HPV18HPV18型感染者是预后不良的重要指标，型感染者是预后不良的重要指标，HPV18HPV18阳性阳性5 5年存年存活率活率54.1%54.1%，而其他高危型感染的存活率为，而其他高危型感染的存活率为83.8%83.8%。HPV18HPV18型阳性者复发率型阳性者复发率53

4、.6%53.6%，而，而HPV16HPV16型复发型复发率仅为率仅为15.9%15.9%v5151例宫颈癌手术患者中，例宫颈癌手术患者中，9 9例发生淋巴转移中有例发生淋巴转移中有6 6例为例为HPV18HPV18型型v107107例晚期宫颈癌患者放疗治疗组中，例晚期宫颈癌患者放疗治疗组中，HPV18HPV18型阳性者型阳性者5 5年存活率为年存活率为15.5%15.5%，而，而HPV16HPV16型为型为73.1%73.1%对于群体而言对于群体而言HPV16HPV16型感染危害最大型感染危害最大对于个体而言对于个体而言HPV18HPV18型感染危险度最高型感染危险度最高 （2）16、18亚型

5、持续感染的危险性大于其他亚型亚型持续感染的危险性大于其他亚型v 对巴西1611名妇女在4个月间隔2次检测HPV，HPV16，18持续阳性致HSIL风险性大于其他高危型HPV持续阳性。（Nicolas F.Schlecht,et.al.JAMA.2001;286(24):3106-3114.）宫颈癌的必要条件高危型的HPV感染HPV持续感染（3）针对不同型别的感染采取不同的处理方案）针对不同型别的感染采取不同的处理方案v 相同细胞及组织学类型相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待阳性与阴性要区别对待v 不同不同HPV感染型别要区别对待感染型别要区别对待 例如：建议HPV16,18型的患者

6、直接进行阴道镜检查；而对于其他型别的感染，要结合细胞学诊断，一般不需要采取任何治疗方法，但需要按时随访。44 44岁女性，岁女性，20082008年年1010月月2424日，妇检宫颈光滑，滴虫（日，妇检宫颈光滑，滴虫（+）HPV16HPV16，5252（+），TCTTCT：炎细胞中度。：炎细胞中度。未行阴道镜检查未行阴道镜检查，20102010年年1010月月1818日。阴道镜下宫颈活检日。阴道镜下宫颈活检病理病理:鳞状细胞癌（中分化）。未按规范筛查及随访，导致宫颈癌发生。鳞状细胞癌（中分化）。未按规范筛查及随访，导致宫颈癌发生。广东省妇幼保健院广东省妇幼保健院案例分析 荧光荧光PCR原理原理

7、 在PCR反应体系中有上下游引物，在荧光PCR体系中也有上下游引物，还加入了一个荧光基团-探针 在PCR扩增过程中,特异性引物和探针分别与靶序列结合，由于此时荧光基团与猝灭基团离的很近，猝灭基团对荧光基团的发光起到了抑制作用，因此荧光基团不发光。Taq酶在引物的引导下复制靶序列；当遇到结合在两条引物之间的探针时，发挥5端外切酶功能，将探针水解，水解下来的荧光基团受激发发射荧光，每合成一条DNA链发射一次荧光信号。当靶序列呈指数增长时，发射的荧光信号量相应增长，因此只要标本中含相应型别的HPV病毒就会有荧光信号的积累，从而达到检测HPV DNA的目的。荧光猝灭HPV系列产品系列产品v1313种高

8、危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）不分型不分型v1414种高危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）对对HPV16、18分型分型产品特点产品特点至少需要四通道以上的荧光PCR检测仪器，一次检测出14种高危HPV型别：HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59,HPV-66和HPV-68，同时能对HPV16和

9、HPV18进行分型检测。具有-globin基因内对照，可以监测所检测样本的可靠性。在全封闭体系中完成扩增与检测，有效控制污染操作简便，自动化操作，完成整个过程只需要2-3个小时。检测区域设计在HPV基因组E E区区，避免造成漏诊。70%-80%的宫颈癌都的宫颈癌都是由是由HPV16、18型感染型感染引发的引发的，可见在HPV荧光分型的产品中，对HPV16、18分型的重要性SFDASFDA与欧盟的CECE认证 资质资质DNA提取提取 取取800ul800ul样本离心得沉淀样本离心得沉淀 加入细胞裂解液加入细胞裂解液50ul50ul，煮沸，煮沸10min10min 12000 12000离心离心1

10、0min10min即可上机即可上机若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应注意防止爆盖：金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点优点：简单、快捷、方便。：简单、快捷、方便。缺点缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。抑制剂。v 针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本）（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致PCR试剂配制试剂配制v 按样本数加入

11、所需溶液的对应量，充分混匀再分装按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装仪器检测通道选择仪器检测通道选择 我们一般把荧光我们一般把荧光PCR的前的前15个循环信号作为荧光本底信号（个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。检查检查调整调整基线基线 荧光阈值的缺省设置是荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（仪器自动设置，倍（仪器自动设置，auto）。但我们通常采用手动设置

12、（）。但我们通常采用手动设置（manual），手动设置的原则是该阈值要大于样本的荧光背景值和阴性对），手动设置的原则是该阈值要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号出现在荧光信号超过阈值后。的信号出现在荧光信号超过阈值后。检查检查调整调整阈值阈值结果分析1 定性结果判读定性结果判读1）阴性对照）阴性对照Ct值均应显示为值均应显示为Undet。阳性对照阳性对照Ct值值36。符合以上两个条件，此反应是为有效。符合以上两个条件，此反应是为有效。2）样品的）样品的Ct值显示为值显示为Undet，

13、判断为阴性。，判断为阴性。3）样品的）样品的Ct值值40，判断为阳性；，判断为阳性；4）若为）若为40Ct值值45的样本建议重做，重做结果的样本建议重做，重做结果Ct值值40者为阳性，否则为阴性。者为阳性，否则为阴性。5）如果出现）如果出现Ct值值15的强阳性样本，可直接报告为阳性的强阳性样本，可直接报告为阳性或自动分析，并将其从样品表中剔除，再按上面步骤分析其或自动分析，并将其从样品表中剔除，再按上面步骤分析其他样本，或建议进行他样本，或建议进行1/100稀释重做。稀释重做。定性报告单上，定量结果栏及参考定性报告单上，定量结果栏及参考范围设置为范围设置为N/A（无效栏）（无效栏）结果分析1

14、扩增曲线出现交叉扩增曲线出现交叉扩增曲线出现交叉，主要是因扩增曲线出现交叉，主要是因为多引物、多探针反应体系中，每为多引物、多探针反应体系中，每种型别的扩增效率不一样所致。同种型别的扩增效率不一样所致。同时，样本本身的原因也可能造成荧时，样本本身的原因也可能造成荧光曲线的差异。光曲线的差异。常见问题及解决方案2 单个临床样本扩增曲线底部上坡式单个临床样本扩增曲线底部上坡式不断抬高不断抬高加入的样本加入的样本DNA含有很多杂质。含有很多杂质。重做重做，加样前，样本，加样前，样本DNA 13000rpm离心离心10分钟，移液时取上清，移液器枪头浸分钟，移液时取上清，移液器枪头浸入液面入液面2mm处

15、。处。3 个别荧光曲线突然个别荧光曲线突然(较大较大)下降下降反应管内留有气泡，由于温度升高反应管内留有气泡，由于温度升高后可能会造成气泡破裂，使荧光值突变后可能会造成气泡破裂，使荧光值突变降低降低，加入模板加入模板DNA后混匀离心，把后混匀离心，把反应管放置仪器内时要检查管内是否有反应管放置仪器内时要检查管内是否有气泡。气泡。4 阴性对照产生较高荧光阴性对照产生较高荧光反应反应MIX被污染；反应管不干净，被污染；反应管不干净，有杂物；反应过程中探针降解。有杂物；反应过程中探针降解。5 标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳加样存在误差，使得标准品不呈梯加样存在误差，使得标准品不呈梯度；

16、度；标准品出现降解，应避免标准品反标准品出现降解，应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。复冻融，或重新制备并稀释标准品。常见问题及解决方案6 阈值设置不同，是否会导致阴阳性结果判断的不统一？阈值设置不同，是否会导致阴阳性结果判断的不统一？结果的判读不能只依赖于结果的判读不能只依赖于Ct值的大小，还要看是否出现明显的扩增曲线。二者值的大小，还要看是否出现明显的扩增曲线。二者结合才能判断试验结果。结合才能判断试验结果。阈值设置的高低会使阈值设置的高低会使Ct值有一定的变化，但变化一般都比较小。只有很少的样值有一定的变化，但变化一般都比较小。只有很少的样本会出现在本会出现在Ct=40左右波动

17、。这样的样本如扩增曲线明显可以判读为阳性，如扩左右波动。这样的样本如扩增曲线明显可以判读为阳性，如扩增曲线不明显或荧光增长值不高则建议重做。增曲线不明显或荧光增长值不高则建议重做。常见问题及解决方案7 检测方法中检测方法中“定性定性”和和“定量定量”的问题的问题目前，尚没有任何一种检测方法可以达到目前，尚没有任何一种检测方法可以达到“定量定量”检测检测HPV病毒的目的。这是由于病毒的目的。这是由于采样方法本身的局限性所造成的：采样方法本身的局限性所造成的：在采集宫颈脱落细胞的过程中，虽然反复强调要采集在采集宫颈脱落细胞的过程中，虽然反复强调要采集“HPV易感区易感区转化带转化带”的脱落细胞，但

18、由于不同操作人员对的脱落细胞，但由于不同操作人员对“易感区易感区”部位的判断以及取样手法的不同，我部位的判断以及取样手法的不同，我们不能准确评估出取得的细胞样品中携带病毒分子的细胞数量。们不能准确评估出取得的细胞样品中携带病毒分子的细胞数量。比如：在第一次采集细胞样品时，取得了比如：在第一次采集细胞样品时，取得了500个携带病毒分子的细胞，经过检测后个携带病毒分子的细胞，经过检测后，我们得出患者携带病毒数量是，我们得出患者携带病毒数量是500；而对同一位患者进行第二次采集细胞时，由于；而对同一位患者进行第二次采集细胞时，由于多刷了一圈或者恰恰取到了多刷了一圈或者恰恰取到了“病灶区病灶区”，所以

19、取得了，所以取得了1000个携带病毒分子的细胞，个携带病毒分子的细胞，经过检测，又得出携带病毒数量是经过检测，又得出携带病毒数量是1000。因为采样操作本身的问题，使得前后这两。因为采样操作本身的问题，使得前后这两个数字已经失去了它所具有的含义，因此，再将这两个数字放在一起比较也就不具有个数字已经失去了它所具有的含义，因此，再将这两个数字放在一起比较也就不具有任何实际意义。而且，因为病毒载量与病变程度之间的关系尚没有完全阐明，所以任何实际意义。而且，因为病毒载量与病变程度之间的关系尚没有完全阐明，所以HPV病毒的定量检测对临床治疗没有任何指导意义。病毒的定量检测对临床治疗没有任何指导意义。如果一定要使用如果一定要使用“定量定量”这个词语，那也只能在前面再加上这个词语，那也只能在前面再加上“相对相对”二字。因为，二字。因为，这个这个“定量定量”仅仅是将采集到的细胞样品中的病毒数量进行了仅仅是将采集到的细胞样品中的病毒数量进行了“定量定量”，而不是对患，而不是对患者本身所携带的病毒数量进行者本身所携带的病毒数量进行“定量定量”。常见问题及解决方案创新专业创新专业追求卓越追求卓越