QPCR技术细节解析课件.ppt

1、程涛程涛中国科学院生物化学与细胞生物学研究所中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细节决定成败QPCRQPCR的技术细节对实验结果的影响的技术细节对实验结果的影响内容概要内容概要 荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR的标记方法的标记方法 实验流程及注意事项实验流程及注意事项 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始

2、模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理 扩增曲线扩增曲线 荧光阈值荧光阈值 Ct值值荧光定量荧光定量PCR原理原理 在在PCR反应中，反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期反应初期，目的，目的DNA片段呈片段呈指数扩增指数扩增。随着目的。随着目的DNA产产物逐渐积累，在引物一模板与物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现相对稳定状态，即出现“停滞效应停滞效应”，又

3、称，又称“平台期平台期”。到。到达平台期所需达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行聚合酶一般要进行25次以上次以上PCR循环。循环。多数情况下，平台期在多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。反应中不可避免。PCR产物的积累规律产物的积累规律 PCR产物的积累规律示意图产物的积累规律示意图荧光定量荧光定量PCR定量原理定量原理扩增曲线荧光定量荧光定量PCR定量原理定量

4、原理为什么终点定量不准确呢？为什么终点定量不准确呢？荧光定量荧光定量PCR定量原理定量原理 尽管终点产物的量不恒定，但人们发现尽管终点产物的量不恒定，但人们发现CtCt（cycle thresholdcycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。与模板起始浓度有密切联系。Ct值的定义：值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数CycleCycle（循环数）（循环数）RnRn（荧光强度）（荧光强度）Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个

5、循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光阈值荧光阈值定量定量PCR的数学的数学原理原理定量定量PCR的数学的数学原理原理定量定量PCR的数学原理的数学原理定量定量PCR的数学原理的数学原理Cycle numberCycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration1 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。1 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检

6、测灵敏度确认检测灵敏度确认No Template Control(NTC)No Template Control(NTC)确认确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.9-1.1:0.9-1.135Cycles35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量荧光定量PCR反应性的确认反应性的确认内容概要内容概要 荧

7、光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR的标记方法的标记方法 实验流程及注意事项实验流程及注意事项 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法非特异性荧光标记非特异性荧光标记 SYBR Green I特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan Probe常用荧光标记方法常用荧光标记方法SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法作用机理作用机理问题点：问题点：SYBR Green ISYBR

8、 Green I与双链与双链DNADNA进行结合后散发荧光，因进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有此如果反应体系中有非特异性扩增非特异性扩增或或引物二聚体引物二聚体的产生，的产生，也将也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲线融解曲线融解曲线分析，单一融解曲线分析，单一峰无非特异

9、性荧光峰无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准性荧光，因此定量不准确确SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲线融解曲线%对对DNA模板没有选择性模板没有选择性%使用方便，不必设计复杂探针使用方便，不必设计复杂探针%具有价格优势具有价格优势优优 点点%容易产生假阳性容易产生假阳性%对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高%不能进行多重定量不能进行多重定量缺缺 点点SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法优缺点优缺点TaqmanTaqman探针法探针法原理原理

10、 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqmanTaqman探针法探针法工作机理工作机理1 1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2 2、反应参数的确定：、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化

11、退火温度 3 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小CtCt值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4 4、其他与常规、其他与常规PCRPCR相同相同TaqmanTaqman探针法探针法PCRPCR体系的建立体系的建立TaqmanTaqman探针法探针法荧光标记物的选择荧光标记物的选择%高度特异性高度特异性%重复性好重复性好%可进行多重定量可进行多重定量优优 点点%只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标%委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高%不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点Taqman

12、Taqman探针法探针法优缺点优缺点不同定量方法的比较不同定量方法的比较方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I SYBR Green I 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性易出现非特异性带带不能进行多重定不能进行多重定量量适合科研中对各种目的适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重达量的研究，转基因重组动植物的研究组动植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好多重定量多重定量价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药病原体检测，

13、疾病耐药基因研究基因研究,药物疗效考药物疗效考核核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR的标记方法的标记方法 实验流程及注意事项实验流程及注意事项 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法样品制备样品制备模板准备模板准备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器软件仪器软件RTRT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法样品制备样品制备环境要求环境要求模板准备模板准备数据分析数据分析RTRT上机上机浓度确定浓度确定无RNas

14、e环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具分光光度计检测电泳检测RTRT反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析上机上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物模板准备模板准备引物设计引物设计浓度确定浓度确定环境要求环境要求误差控制误差控制RTRT样品制备样品制备数据分析数据分析上机上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照GC：5060Tm：5560单个碱基重复4个无二级结构扩增长度：50150bp引物位置反应体系优化反应体系优化

15、上机上机反应条件优化反应条件优化RTRT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析反应体积5ul，推荐2050ulMg2调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求技能要求误差控制误差控制上机上机试剂选择试剂选择RTRT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析自配DBI Real mastermixRoche-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI

16、-7seriesBioerLinegene series分装控制内参控制机器校正控制45oC55oC65oC溶解曲线溶解曲线扩增曲线扩增曲线1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Read7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readevery 0.2oC,hold 1 sec.同一cDNA样品的三个重复如图一系列梯度稀释的

17、模板，理论上它们在扩增曲线上的如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CTCT值之差，应该相等，但值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品是后边几个浓度低的样品CTCT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。物二聚体引起的误差非常严重。1.1.模板浓度越低，染料法的误差越大模板浓度越低，染料法的误差越大2.2.某一孔荧光信号特别强某一孔荧光信号特别强原因：原因：试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分

18、的量不同；试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；也可能是也可能是PCRPCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；3.3.样品浓度跨度过大样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，4.部分样本扩增效率过低部分样本扩增效率过低原因：原因：提取液残留，一定程度抑制了提取液残留，一定程度抑制了PCRPCR反应；反应；反应液未严格取量混匀或分装不反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；均匀；试剂失效；5.5.阴性对照或空白对照翘尾阴性对照或

19、空白对照翘尾原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染；原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染；6.6.直线型扩增曲线直线型扩增曲线原因：探针部分降解（探针降解原因：原因：探针部分降解（探针降解原因：a.a.探针反复冻融探针反复冻融稀释的探针可在稀释的探针可在44保存保存至少至少3 3个月，应避免反复冻融；个月，应避免反复冻融；b.b.探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有PCRPCR抑制抑制物；物；7.7.山坡形曲线山坡形曲线原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。原因：常因反应管封口不严，至反应液

20、蒸发所致。8.8.扩增曲线断裂扩增曲线断裂原因：基线选取范围不对，基线终点大于原因：基线选取范围不对，基线终点大于CtCt值，这通常是由于模板值，这通常是由于模板DNADNA浓度过高所致，浓度过高所致，因因CtCt值值1515，而基线范围仍取，而基线范围仍取3 31515，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至高，解决办法：减少基线终点至CtCt值前值前4 4个循环，重新分析数据个循环，重新分析数据9.9.基线下滑基线下滑原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；原因：基线选取范围

21、不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；10.10.没有扩增曲线没有扩增曲线原因：原因：PCRPCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即即stage 1stage 1阶段；电脑设定了自动休眠；阶段；电脑设定了自动休眠；11.扩增曲线有一向上或向下的尖峰扩增曲线有一向上或向下的尖峰原因原因：反应过程中电压不稳定；可能在反应过程中电压不稳定；可能在2020循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；使得光线突然增强；如果尖峰向下，也可能是卤素

22、灯老化所致，这时应更换；如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；数据分析数据分析软件系统软件系统分析方法分析方法上机上机RT样品制备样品制备模板准备模板准备相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法内容概要内容概要 荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR的标记方法的标记方法 实验流程及注意事项实验流程及注意事项 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法绝对定量解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 根据样品

23、Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆质粒质粒基因组基因组DNADNA质粒标准品的制备质粒标准品的制备拷贝数的计算：拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014倍比梯度稀释方法倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算q 方方 法

24、：法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测q 试试 剂：剂：DBIDBI公司SYBR realtime PCR试剂q 标准品：标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照q 实验步骤：实验步骤：提取RNA并反转录；设计特异引物；荧光定量扩增；结果分析：获取样品中目的基因的精确copy数。绝对定量实验例绝对定量实验例SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.

25、04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据实验数据绝对定量实验例绝对定量实验例扩增效率（扩增效率（E E）计算）计算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct Mean Ct 作图可得到标准曲作图可得到标准曲线线y=-3.17x+37.52 R2=0.9988绝对定量实验例绝对定量实验例未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.17

26、26 X+37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 绝对定量实验例绝对定量实验例X=20.5-37.52-3.1726=5.36相对定量解析方法相对定量解析方法相对定量的必要性相对定量的必要性管家基因筛选管家基因筛选P P P P P P O O 双标准曲线法双标准曲线法 2-Ct法法 两种常用的分析方法两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。为相对表达量。相对值相对值=校正值校

27、正值=目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值双标准曲线法双标准曲线法公式：公式：优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一双标准曲线法双标准曲线法检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6

28、391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874实验数据实验数据公式：公式：F=F=2 22 2-CtCt法法优点：无需作标准曲线优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为缺点：假定扩增效率为 100%100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂实验条件优化较为复杂

29、应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值实验数据：实验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952 2-CtCt法：法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%100%Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct

30、2（2.4）=5.3 所以所以JunJun基因在处理后表达水平比处理前高基因在处理后表达水平比处理前高5.35.3倍倍2 2-CtCt法法Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 in Macrophages Restrains TLR4-NF-B Signaling and Protects against Endotoxin Shock.Immunity.(2014)(影响因子：20.72)HCV-Induced miR-21 Contributes to Evasion of Host Immune Syste

31、m by Targeting MyD88 and IRAK1.Plos Pathog.(2013)(影响因子：9.12)Inhibition of Lysyl Oxidase Ameliorates Inflammation and Experimental Pulmonary Fibrosis.J MOL CELL BIOL.(2014)(影响因子：7.31)Exogenous Melatonin Modulates Apoptosis in the Mouse Brain Induced by high-LET Carbon Ion Irradiation.Journal of Pineal Research.(2012)(影响因子：5.79)Expression of CIP2A in Renal Cell Carcinomas Correlates With Tumour Invasion,Metastasis and Patients Suvival.British Journal of Cancer.(2011)(影响因子：5.08)程程 涛涛： 张彦波张彦波：党希龙党希龙：谢谢大家！祝大家实验顺利！