ngs与其他检测序技术流程的对比课件.ppt
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1、Nanjing TorontoStanford保密Strictly Private&ConfidentialToronto Stanford Nanjing多伦多斯坦福 南京世和基因内部培训材料 NGS与其他检测序技术流程的对比2016年7月 Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.临床常用诊断技术2Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.肿瘤诊断方法影像学诊断:超声,CT,MRI,PET,PET-CT组织细胞形态学诊断:-HE染色 -辨别
2、肿瘤细胞及分型免疫组化诊断:-利用抗原抗体结合反应原理 -针对蛋白类肿瘤标记物(癌胚抗原,糖类抗原,甲胎蛋白等)的检测 -鉴别组织来源分子诊断:-荧光原位杂交(FISH)、基因探针及标记、多聚酶链式反应(PCR)、DNA序列分析(sanger测序、ARMS法、二代测序)等 -针对肿瘤的癌基因/抑癌基因、生长因子及受体,以及肿瘤相关的某些染色体 位点异常的检测 3组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”4ACSCSCCLC FISH ARMS肿瘤肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代 免疫组化 一代测序 数字PCR 二代测序检测方法的介绍u免疫组化(IHC)u荧光原位杂交(FISH)u桑格测序(Sa
3、nger测序法)u扩增阻滞突变(ARMS)-PCR法u数字PCR(ddPCR)u二代测序6Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.检测方法介绍免疫组化染色7原理:根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合,再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应,前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合,最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分,在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞爬片或组织切片上
4、原位确定某些化学成分的分布和含量。免疫组化是从蛋白层面看问题的,与测序不同,一个是因(DNA),一个是果(Protein),所以体内出现一些未知突变,如果对蛋白功能产生影响,也是可以看出来的。0分1分2分3分荧光原位杂交(FISH)定义:荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交,并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核
5、酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。分析9Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.荧光原位杂交(FISH)检测以HER2为例FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例高倍扩增无扩增扩增无扩增DNA序列测定的意义 DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制
6、备、基因与疾病的关系等等,都要求对DNA一级结构的详细了解。桑格测序原理 原理:利用DNA聚合酶,以待测单链DNA为模板,以dNTP为底物,设立四种相互独立的测序反应体系,在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链延伸终止剂。在测序引物引导下,通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,放射自显影检测后,合成链序列,由此推知待测模板链的序列。13Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.Sanger测序的流程结果解读扩增阻碍突变系统(ARMS)-又称等位基因特异性扩增(ASA),利用PCR引物的3 端
7、末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,设计等位基因特异性 PCR扩增引物。ARMS(ASA)的特点是:“只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带,野生型的不扩增”优势灵敏度高,重复性好,对标本突变率要求底操作简单,仪器费用较低廉检测时间短不足仅能检测已知突变类型不能得到具体碱基突变类型ARMS法检测16数字微滴PCR(ddPCR)通过将微量样品扩大倍数稀释和分液(partitioning),直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个,再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增,并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。Copyright 2016.GENESEEQ Te
8、chnology Inc.All rights reserved.ddPCR的工作流程原理是在Sanger测序方法的基础上,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP。通过碱基互补配对原则逐一的添加标记过的dNTP,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机识别、转换,从而生成相应的序列信息。18新一代高通量测序(NGS)的原理四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章,绝大多数使用Hiseq平台新一代高通量测序(NGS)能同时检测不同形式的基因突变 Marc Ladanyi.2015 A
9、SCO Annual Meeting19 检测方法比较检测方法优势劣势可检测的变异形式AMRS-PCR1、灵敏度3%-10%2、扩增和检测同时进行,封闭的体系,减少污染的可能性1、只能检测已知突变2、如果检测突变点或者类型较多,出现特异产物概率也增加3、当检测位点较多时,对DNA样本需求增加点突变、小片段插入/缺失无法测融合、大片段以及热点测序荧光原位杂交FISH1、灵敏度高、特异度高2、空间定位准确,可同时分析分裂期和间期多个细胞,并进行定量1、通量低、成本高2、对操作和判读技术要求高,不同读片者判读差异较大拷贝数变化、大片段插入/缺失、融合/重排。扩增的金标准免疫组化IHC1、可对组织和细
10、胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究2、经济快捷1、抗体的选择2、检测者组织的固定3、观察者解释方面的差异仅检测蛋白表达水平Sanger测序1、测序长度2、准确性高,灵敏度20%-30%3、能处理的处理重复序列和多聚序列1、通量低、成本高2、对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高3、灵敏度低点突变、小片段插入/缺失二代测序1、大规模、高通量2、能检测各种变异形式3、灵敏度1%-3%1、成本较高2、引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率,并且具有系统的偏向性,同时读长也比较短3、对数据注释和报告解读要求高点突变扩增融合/重排插入/缺失20Copyright 2013.GENESEEQ Te
11、chnology Inc.All rights reserved.各种方法检测的对比方法检测层面样本需求优势劣势IHCProtein组织 直接展现表达结果,直观主观判断,对操作人员要求较高,阳性判定不确定ARMSDNA组织,血液速度快,精准度较高无法测融合,扩增及大片段测序,热点测序ddPCRDNA组织,血液单位点精准度非常高,可以进行动态监测多位点血检匹配度不高,热点测序FISHDNA组织扩增是金标准,并且可以测融合主观判断,对操作人员要求较高,对融合的判别要求非常高,结果容易出错世和DNA/RNA普适性一次检测所有突变类型,多基因,精准度高价格略高,周期略长21Copyright 2016
12、.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.总结Summary22Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.NGS只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型FISH做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高,NGS通过优化算法,降低人工出错的比率。阴性对照极为重要,具有质控和探查种系突变的作用ARMS,ddPCR等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高,但是本质上仍旧是热点测序,不能满足越来越大的检测需求世和专有探针库保证了前期提取的DNA质量NGS&ctDNA 技术
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