免疫荧光技术(修改)课件.ppt
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- 免疫 荧光 技术 修改 课件
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1、免疫标记技术 用可以微量检测的标记物用可以微量检测的标记物(示踪示踪物质)标记抗原或抗体物质)标记抗原或抗体,作为试剂,作为试剂,与相应抗体或抗原结合反应后,测定与相应抗体或抗原结合反应后,测定抗原抗体复合物中的标记物,从而推抗原抗体复合物中的标记物,从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。断所测抗体或抗原有无及量的多少。常常 用用 标标 记记 物物 荧光素 酶 同位素 胶体金 可发光化学物质试验命名:根据标记物命名 如:免疫荧光技术 免疫酶技术等免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunological fluorescent technique,IF)原理:用荧光素标记抗原或抗体,与待测标本中相应
2、抗体或抗原结合,通过检测荧光,确定标本中有无待测的抗体或抗原。免疫荧光技术分类:免疫荧光显微技术(定性)免疫荧光测定技术(定量)一.荧光、荧光素及荧光显微镜(一)荧光 一种光照射某种物质时,该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光(二)荧光素 能产生荧光的物质,可作为染料。常用荧光素常用荧光素:1.异硫氰酸荧光黄异硫氰酸荧光黄(FITC)可发出可发出黄绿色黄绿色荧光荧光2.四乙基罗丹明(四乙基罗丹明(RB200)发出发出橘红色橘红色荧光荧光3.藻红蛋白(藻红蛋白(PE)发出发出橙色橙色荧光荧光(三)荧光显微镜(三)荧光显微镜 1.结构结构:主要组成主要组成 A.白炽光源
3、白炽光源(超高压汞灯):发射紫外光或(超高压汞灯):发射紫外光或兰兰 紫光紫光;B.两组滤光板两组滤光板:激发滤板(选择合适的激发光激发滤板(选择合适的激发光谱);抑制滤板(抑制紫外光或兰紫光进入视谱);抑制滤板(抑制紫外光或兰紫光进入视野野,只允许荧光通过。只允许荧光通过。C.显微镜显微镜:普通的光学显微镜:普通的光学显微镜。光路程序光路程序:白炽光源 发射紫外光or兰紫光 激发滤板 紫外光 被检物(荧光染色标本)紫外光荧光 抑制滤板荧光(显微镜下可见)目镜阻挡滤镜载玻片荧光显微镜光路示意图荧光显微镜光路示意图光源隔热滤片激发滤片聚光器物镜荧光显微镜光路示意图荧光显微镜光路示意图荧光显微镜据
4、光源路径分荧光显微镜据光源路径分 透射式(光源从下面经聚光器会聚后到达样品,适用于观察对光可透的标本)落射式(光源从上面到达样品,经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等)2.使用注意事项:染色后立即检查(荧光易猝灭)准备好后开启白炽光源,不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭每次使用2小时保持室内通风 荧光素可以标记(染色)抗原,也可以标记抗体 标记抗原 用得少 标记抗体 用得多 一般免疫荧光显微技术均标记抗体二二.免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(一)荧光抗体的制备(二)片子的制作(三)荧光抗体染色方法(一)荧光抗体的制备:纯化的一定量抗体 加一定量FITC(搅拌使结合
5、)去除游离荧光素 测抗体效价、测荧光素与蛋白质(Ab)结合比(F/P)小量分装保存备用(二)片子的制作:1.常做切片、涂片、印片,要求薄、均匀,并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同(无水已醇、丙醇、聚甲醛等)(三)荧光抗体染色法 快、直接、干扰因素少快、直接、干扰因素少 用于检测抗原用于检测抗原 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体体,较麻烦较麻烦洗涤洗涤,AgAb2.间接法 分两步:第一步:荧光素标记抗抗体(如荧光 标记的羊抗人IgG);第二步:已知Ag固定待测标本(Ab?)洗涤,荧光标记的 抗抗体洗涤,荧光显微镜镜
6、检 间接法用得最多优点:制备一种荧光标记二抗(抗抗体)可用制备一种荧光标记二抗(抗抗体)可用于多种于多种Ab检测检测灵敏度高灵敏度高3.补体法:第一步:荧光素标记抗补体;第二步:已知Ag固定待测标本(Ab?)补体洗涤,荧光标记的抗补体洗涤,荧光显微镜镜检特点:灵敏度高灵敏度高,制备一种荧光抗补体用于多制备一种荧光抗补体用于多 种检测种检测 干扰因素多,补体不稳定,干扰因素多,补体不稳定,易失活,易失活,该法该法少用少用4.双标记法 用两种荧光素(FITC、罗丹明)分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体,对同一标本染色,当Ag有两种相应抗原表位存在时,可同时见到黄绿和橙红两种荧光。(四)免疫荧
7、光显微技术优缺点优点:1.特异性、敏感性高 2.快速 3.可定位 4.既可测Ag又可测Ab缺点:1.需要荧光显微镜2.存在非特异荧光干扰(产生原因:自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题)3.定性测定、判断结果不客观4.制备的片子难以长期保存(荧光猝灭)三.时间分辨荧光免疫测定(液相检测)原理原理:用用铕铕(Eu)(Eu)等具等具有较长荧光寿命有较长荧光寿命的稀土的稀土金属金属作荧光标记物作荧光标记物来标记来标记AbAb或或Ag Ag,从而检测待从而检测待测标本中相应测标本中相应AgAg或或AbAb的新技术。的新技术。其特点是其特点是:利:利用用时间分辨荧光仪时间分辨荧光仪延缓检测时间,延缓检测时
8、间,排除非特异性干扰荧光。排除非特异性干扰荧光。灵敏度可达灵敏度可达0.20.2 1 1 ng/ml ng/ml。思考题:1.免疫标记技术的原理2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么?3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点免疫酶技术免疫酶技术Immunoenzyme technique概述:70年代初在免疫荧光技术基础上建立。年代初在免疫荧光技术基础上建立。较较IF、RIA(radioimmunoassay)更优更优 越越 ,具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点原理原理:利用利用酶酶标记标记Ag或或Ab后不改变后不改变Ag、Ab反应特异性反应特异性,同时
9、又不影响酶的活性,结同时又不影响酶的活性,结合在合在AgAb上的酶催化底物,生成有色产上的酶催化底物,生成有色产物,根据物,根据产物颜色深浅产物颜色深浅推测出待测物中相推测出待测物中相应物质(应物质(Ab、Ag)有无及含量多少。有无及含量多少。免疫酶技术具有 特异性 Ag、Ab反应 敏感性 酶的高效催化作用 酶免疫组织化学染色技术(免疫组化)酶免疫测定法(酶联免疫吸附实验,Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)常用的酶(一)选择酶的要求1.自然界存在广,易获得2.易纯化、性稳、活力高3.形成的酶结合物稳定,并保留酶、抗体或抗原的活性4.底物来源方便并易
10、保存5.反应后有色产物能快速测定6.酶分子量不能太大,太大不易进入组织细胞内,影响组化染色定位(二)常用的酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)一种铁卟啉蛋白质,分子量4.4万,能进入细胞内酶活性强,酶结合物可长期保存最适pH为5.5左右 选用时注意酶纯度和活性纯度:RZ表示,反映酶含量与蛋白含量之比,最好要RZ值为3.0左右活性:每1mg酶中所具有的活性单位,应大于250u/mg HRP的底物:邻苯二胺邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺(四甲基联苯胺(TMB)反应体系中作为供氢体反应体系中作为供氢体DH2+H2O2 D+
11、2H2O供氢体供氢体 受氢体受氢体 有色产物有色产物 HRPOPD特点特点:有色产物为黄色有色产物为黄色 空白对照接近无色空白对照接近无色 敏感度高敏感度高,有致癌作用有致癌作用TMB特点:特点:有色产物为蓝色有色产物为蓝色 无致癌作用无致癌作用底物系统(包括供氢体、受氢体)临用时配,配后避光保存酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked immunosorbent assay)ELISA 一.原理:将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物(酶标记物),当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇,形成酶标记的AgAb复合物,加入底物,酶催化底物,生成有色产物,根据颜色深浅可测出溶液中Ag
12、或Ab的量。实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备:纯化后的抗体纯化后的抗体+酶酶 透析去除游透析去除游离酶离酶 测定酶标抗体工作浓度测定酶标抗体工作浓度试验中有关术语及试剂:包被包被(coat):将将Ag或或Ab吸附在固相吸附在固相载体上的过程载体上的过程,又称固相化或吸附。包被后,又称固相化或吸附。包被后,不能被洗脱。包被缓冲液:不能被洗脱。包被缓冲液:PH9.6 CB 洗涤洗涤(wash):PH7.2-7.4 PBS 酶结合物酶结合物:酶标抗体或酶标抗原酶标抗体或酶标抗原 终止液终止液:2M H2SO4OPD:HRP催化后其有色产物为黄色催化后其有色产物为黄色,H2SO4终止终止后变
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