免疫细胞的分离及检测技术课件.ppt

1、第十四章第十四章 免疫细胞的分免疫细胞的分离及其表面标志检测技术离及其表面标志检测技术免疫细胞免疫细胞 所有与免疫相关的细胞都属于免疫细所有与免疫相关的细胞都属于免疫细胞胞.淋巴细胞淋巴细胞 抗原提呈细胞抗原提呈细胞(APC)(APC)其他其他第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBM

2、C）包括淋巴细胞和单包括淋巴细胞和单核细胞（核细胞（monocyte）。）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为

3、1.075-1.090 Ficoll分离液分离液-聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺溶液泛影葡胺溶液2 2份份6%6%聚蔗糖蒸馏水溶液聚蔗糖蒸馏水溶液+1+1份份34%34%泛影葡胺生理盐水溶液，泛影葡胺生理盐水溶液，比重为比重为1.0771.077 0.002 0.002用用1.0771.0770.0010.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 磁铁吸引法磁铁吸引法 PercollPercoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）（去单核细胞）（去单核细胞）原理：利用单核细胞具有贴原理：利用

4、单核细胞具有贴壁生长的特点壁生长的特点贴壁粘附法贴壁粘附法原理：利用单核细胞具有贴壁原理：利用单核细胞具有贴壁生长的特点生长的特点吸附柱过滤法吸附柱过滤法原理：利用单核细胞具有吞原理：利用单核细胞具有吞噬噬 功能的特点功能的特点磁铁吸引法磁铁吸引法 E E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞+SRBC悬液悬液加入分层液加入分层液T细胞形成细胞形成E花环花环而沉于管底而沉于管底悬液中为悬液中为B细胞。细胞。E E花环沉降法花环沉降法 方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞通过聚酰通过聚酰胺纤维管胺纤维管洗脱下来

5、的是洗脱下来的是T细胞细胞尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 方法：将所需的细胞对应的方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被于小管内单克隆抗体包被于小管内加入淋巴细胞加入淋巴细胞形成形成Ag-Ab复合物复合物洗去不反应的物质。洗去不反应的物质。亲和板结合分离法亲和板结合分离法磁珠大小可以选择磁珠大小可以选择大小免疫磁珠分离细胞的特点比较大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对细胞造成机械压

6、力，影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离其生物学活性，不利于分离后培养。后培养。对细胞温和，不影响分离细对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。响散射光。可直接上流式细胞仪检测，可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。不影响散射光。分离条件要求分离条件要求技术简单，分离可在试管中技术简单，分离可在试管中完成。完成。需要很强的磁场来分离细胞。需要很强的磁场来分离细胞。收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。纯度纯度纯度低。纯度低。纯度高。纯度高。分离时间分离时间分离速度快。

7、分离速度快。分离速度慢。分离速度慢。分离成本分离成本成本低。成本低。需要很强的磁场来分离细胞，需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。在普通试管进行。免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统流式细胞分析仪流式细胞分析仪分离细胞的保存及活力测定分离细胞的保存及活力测定 分离细胞的保存：两种方式 细胞活力测定：台盼蓝染色 分离细胞的保存分离细胞的保存 1、短期保存、短期保存用含有用含有10%20%灭活小牛血清的灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培

8、养液可保存数周。培养液可保存数周。2、长期保存及复苏、长期保存及复苏保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196)中保存。中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站立即放入降温过渡站(-80)中，继而进行降温中，继而进行降温(-196)冷冻。冷冻。复苏：将其从液氮中取出，立即放入复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中

9、，融温水中，融化后加入化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。细胞活力的检测细胞活力的检测常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。胞而使细胞着色（蓝色）。第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标常用

10、于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（志是簇分化抗原（Cluster of Cluster of differentiationdifferentiation，CDCD）。）。细胞表面分化抗原（细胞表面分化抗原（CDCD抗原抗原）适用于适用于T T、B B细胞的分离细胞的分离已知已知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离未知未知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离（阴性分选）（阴性分选）一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （c

11、ytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细胞，细胞，B1B1细胞为细

12、胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞细胞仅为仅为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞细胞。三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 人类人类NK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NK细胞。细胞。T细胞及细胞及NK细胞细胞第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞抗原提呈类细胞表面标志抗原提呈类细胞表面标志第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志

13、的检测方法淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义一、免疫细胞表面标志的检测一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。能的重要指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。排斥反应的监测。临床常见疾病中的

14、临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 小小 结结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是数淋巴细胞的表面标志是CDCD抗原。抗原。进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前

15、看来，还很少有只通过一个看来，还很少有只通过一个CDCD抗原就能抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CDCD抗抗原，原，CDCD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。数都是相对特异。根据根据T T细胞的免疫效应功能和表面细胞的免疫效应功能和表面CDCD分子分子表达至少可以分为：辅助性表达至少可以分为：辅助性T T细胞、细胞细胞、细胞毒性毒性T T细胞和调节性细胞和调节性T T细胞；细胞；SmIgSmIg为为B B细胞细胞所特有，是鉴定所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标，以细胞可靠的指标，以CD5CD5和和CD19CD19为标志可将为标志可将B B细胞分为细胞分为B1B1和和B2B2两个亚群；目前多以两个亚群；目前多以CD3-CD3-、CD16+CD16+、CD56+CD56+作为作为NKNK细胞的典型标志。细胞的典型标志。