免疫组织化学染色技术课件.ppt

1、免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术医医 学学 免免 疫疫 学学第第27章章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术 指导教师：王洪江老师指导教师：王洪江老师医 学 免 疫 学第2 7 章 免疫组织化学技术 主讲教师：王兴 35岁女性，左颈淋巴结肿大，岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫描扫描未发现原发灶？临床如何处理？未发现原发灶？临床如何处理？实例行免疫组化染色：肿瘤细胞行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-），），CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠来源），提示结直肠来源。免疫组化：协助临床诊断！活检：提示为腺癌（转移性）活检：提示为腺癌（转移性）肠镜检查在横结肠发现肠镜检

2、查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为腺癌的病灶，活检证实为腺癌。（。（CK7和和CK20联合应用）联合应用）3 5 岁女性，左颈淋巴结肿大，C T 扫描未发现原发灶？作用靶点肿瘤类型Tratugumab(赫赛汀）HER2乳腺癌和胃癌Cetuximab（艾比妥）EGFR结肠癌，非腺癌Bevacizumab（阿瓦斯汀）VEGF转移性大肠癌，肾癌Lmatinib（格列卫）C-Kit胃肠道间质瘤，慢粒Rituximab（美罗华）CD20淋巴瘤某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗免疫组化免疫组化-指导临床治疗方向！指导临床治疗方向！作用靶点肿瘤类型T r a t u g u ma b(赫赛汀）H

3、E R 2 乳腺癌 有利于课题设计和研究工作的开展！有利于课题设计和研究工作的开展！有利于课题设计和研究工作的开展！？免疫组织化学技术第第27章章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术Immunohistochemistry 第五节第五节 免疫金银法免疫金银法第四节第四节 荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术本章主要内容本章主要内容第2 7 章 免疫组织化学技术I mmu n o h i s t o c h e第一节第一节 概述概述第二节第二节 免疫组织化学的关键技术免疫组织化学的关键技术（学习难点）第三节第三节 酶免疫组织化学染色酶免疫组织化学染色本次课程任务免疫组化的概念及原理（重点掌握）

4、免疫组化分类（了解）常用免疫组化方法（熟悉）免疫组化特点（熟悉）第一节 概述第二节 免疫组织化学的关键技术（学习难点）第三v 教学目的：教学目的：免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技术，广泛免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技术，广泛应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更是很多其他免疫应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更是很多其他免疫实验的理论基石。因此通过本次授课，要让同学掌握该项实验原实验的理论基石。因此通过本次授课，要让同学掌握该项实验原理，做到融会贯通。理，做到融会贯通。v 教学要求：教学要求：掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理；掌握免疫组织化学染色技术

5、的概念和原理；熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）。【教学目的与要求】第一节第一节 概述概述 1 2 3 4第一节 概述免疫组织化学技术的概念和原理（理解掌握）1 免疫一、免疫组织化学的概念及原理（一、免疫组织化学的概念及原理（重点掌握重点掌握）（一）概念（一）概念：免疫组织化学：免疫组织化学 immunohistochemistry 将显示剂显示剂（荧光素、酶、金属离子等）标记的特异性抗体在组织或细胞原位原位通过抗原抗体的特异性反应抗原抗

6、体的特异性反应和组织化学的呈组织化学的呈色反应色反应，对相应抗原进行定位、定性及定量测定的一项技术。综合两门技术，并借助显微镜检测各种物质。一、免疫组织化学的概念及原理（重点掌握）（一）概念：免疫组本质本质：组织化学染色：组织化学染色+原位示踪技术原位示踪技术发展历程发展历程：免疫荧光法：免疫荧光法-酶标抗体技术酶标抗体技术酶抗酶复合物酶抗酶复合物技术技术胶体金标记技术以及亲和标记技术胶体金标记技术以及亲和标记技术-出现原出现原位杂交技术及位杂交技术及PCR技术。技术。本质：组织化学染色+原位示踪技术（二）免疫组织化学原理（重点掌握）1.（回顾）理论基础：（回顾）理论基础：（1）抗原（）抗原（

7、antigen）是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。两大特性：两大特性：免疫原性免疫原性、免疫反应性免疫反应性。（二）免疫组织化学原理（重点掌握）1.（回顾）理论基础：是一外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗原处处在抗原处处在（2）抗体（）抗体（antibody）v机体受抗原刺激后由机体受抗原刺激后由B淋巴细胞淋巴细胞,特别是浆特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特细胞分泌产生的

8、一种能与相应抗原发生特异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。v特性：特性：能够与相关抗原能够与相关抗原特异性特异性结合。结合。（2）抗体（a n t i b o d y）（3）酶促反应：）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧抗用酶标记（如辣根过氧化物酶等），与底物发生酶促反应。化物酶等），与底物发生酶促反应。酶促反应的特点：高效性酶促反应的特点：高效性 特异性特异性 操作简单操作简单 条件可控。条件可控。（3）酶促反应：I I 抗用酶标记（如辣根过氧化物酶等），与底物v总结：总结：（1）+（2）+（3）=免疫组织化学的优点：总结：免疫反应+组织化学 结合的产物1.

9、利用了免疫学基本原理：抗原与抗体结合的高度特异性2.免疫组化染色原理：免疫组化染色原理：免疫反应+组织化学 结合的产物1.利用了免疫学基本原理：抗原具体的反应原理?提取靶蛋白（作为抗原）提取靶蛋白（作为抗原）获得鼠获得鼠I抗抗获得获得II抗抗实验实验动物动物酶或生物素酶或生物素酶或生物素标记性II抗标记性标记性II抗抗显色显色DABDAB显色具体的反应原理?提取靶蛋白（作为抗原）获得鼠I 抗获得I I根据标记抗体种类不同 根据染色步骤分类 根据结合方式：抗原抗体结合：如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法）亲和连接二、免疫组织化学分类二、免疫组织化学分类根据标记抗体种类不同 根据染色步骤分类

10、 根据结合方式：抗原抗 酶酶-免疫酶法免疫酶法 荧光染料荧光染料-免疫荧光法免疫荧光法 铁蛋白铁蛋白-免疫铁蛋白法免疫铁蛋白法 胶体金胶体金-免疫金银法免疫金银法 放射性同位素放射性同位素-放射免疫法放射免疫法根据标记抗体不同：酶-免疫酶法根据标记抗体不同：根据染色步骤根据染色步骤直接法：直接法：例例-免疫荧光探针免疫荧光探针间接法：间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。例：两步法，三步法及多步法例：两步法，三步法及多步法 优点：优点：提高灵敏度

11、，提高灵敏度，同时避免多次标记同时避免多次标记I抗抗 图例根据染色步骤直接法：例-免疫荧光探针图例间接法间接法:灵敏性灵敏性三步法、两步法三步法、两步法直接法：特异性直接法：特异性一步法一步法间接法:灵敏性直接法：特异性根据结合方式：根据结合方式：抗原抗原-抗体结合：抗体结合：例如过氧化物酶例如过氧化物酶-过过氧化物酶复合物法氧化物酶复合物法亲和连接法：亲和连接法：ABC法法 S-P法法根据结合方式：抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过氧化物酶复合v免疫荧光法v免疫酶标方法v免疫胶体金技术三、较常用的免疫组织化学方法三、较常用的免疫组织化学方法免疫荧光法免疫酶标方法免疫胶体金技术三、较常用的免疫

12、组织化学1.原理：抗原抗体特原理：抗原抗体特异性结合异性结合 用荧光素标用荧光素标记记I抗进行反应。抗进行反应。2.特点：荧光显微镜特点：荧光显微镜下观察下观察免疫荧光法免疫荧光法1.原理：抗原抗体特异性结合免疫荧光法2.原理：抗原抗体原理：抗原抗体反应，酶标记抗反应，酶标记抗体，加底物显色体，加底物显色3.特色：准、清、特色：准、清、久、兼容。久、兼容。免疫酶标方法免疫酶标方法1.标记物：特殊的标记物：特殊的金属颗粒金属颗粒-胶体金胶体金2.特性：特别适用特性：特别适用于电镜的单标记于电镜的单标记或多标记。也适或多标记。也适用于光镜研究。用于光镜研究。免疫胶体金技术电子显微镜胶体金包埋后染色

13、1.标记物：特殊的金属颗粒-胶体金免疫胶体金技术电子显微镜胶四、免疫组化技术特点：（熟悉）四、免疫组化技术特点：（熟悉）3.形态、代谢和功能三结合形态、代谢和功能三结合4.定性、定位和定量三位一体定性、定位和定量三位一体5特异性强特异性强四、免疫组化技术特点：（熟悉）原始位置的反应：细胞层面原始位置的反应：细胞层面膜、核、浆膜、核、浆 细胞器层面细胞器层面根据标记的种类不同，显色效果不同：荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术光镜、电镜均显色原始位置的反应：细胞层面膜、核、浆根据标记的种类不同，显色形态形态显色反应显色反应代谢、功能代谢、功能抗原含量及位置抗原含量及位置4.定性、

14、定量及定位三位一体存在吗？在哪里？有多少？3.形态、代谢和功能三结合形态显色反应4.定性、定量及定位三位一体存在吗？3.形态、原理决定该特点原理决定该特点“免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！”6、敏感度高ABC法、SP法可使抗体稀释上千倍、上万倍后仍可与组织中抗原结合。原理决定该特点6、敏感度高A B C 法、S P 法可使抗体稀释上千倍小结免疫组化技术的原理小结免疫组化技术的原理用下图来说明以上基本原理：用下图来说明以上基本原理：用下图来说明以上基本原理：免疫组化具体怎么做的呢？免疫组化具体怎么做的呢？免疫组化具体怎么做的呢？Company Lo

15、go第二节、第三节第二节、第三节 免疫组织化学技术基本步骤（难点，实用性强免疫组织化学技术基本步骤（难点，实用性强）二抗孵育二抗孵育组织包埋组织包埋一一抗孵育抗孵育封闭封闭抗原抗原修复修复灭活灭活组织脱蜡组织脱蜡显影显影取材、固定取材、固定制片制片结果判读结果判读长C o mp a n y L o g o 第二节、第三节 免疫组织化学技术基本时间：标本离体后时间：标本离体后30min内取材，并用固定液固定；内取材，并用固定液固定；目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原方法：方法：4%甲醛溶液甲醛溶液机理：使蛋白质发生交联而起

16、固定作用机理：使蛋白质发生交联而起固定作用,影响细胞膜通透性影响细胞膜通透性,抑制酶的消化作用，从抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏）而保护蛋白质免受破坏）1.取材、固定取材、固定目的：使组织保持一定的形状和硬度,易于切片方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等时间：标本离体后3 0 mi n 内取材，并用固定液固定；1.取材、切片：切片：4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。玻片。烤片：烤片：70 2h，目的，目的-充分贴附充分贴附脱蜡：二甲苯溶液，6min*5次，再用乙醇洗掉二甲苯水化、洗涤：PBS浸泡 5min切片：4 u m

17、厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。脱v 目的：暴露抗原目的：暴露抗原,提高通透性提高通透性,增强特异性染色增强特异性染色v 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。v PBS洗涤洗涤 3次次3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化物酶的活性3%H 2 O 2 溶液，室温1 0 mi n，以消除内源性过氧化物酶的活目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）、抗体或标记物不纯、过量等）方法：正常山羊血清封闭液封闭，室

18、温下，方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清。倾去血清适当比例稀释适当比例稀释I抗，抗，37孵育孵育1h或或4冰箱过夜。冰箱过夜。vPBS洗涤洗涤 2min*3次次封闭后勿洗涤！封闭后勿洗涤！滴加生物素化滴加生物素化II抗工作液抗工作液50-100ul室温孵育室温孵育20分分钟，钟，PBS洗涤洗涤2min*3次次目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物11、滴加显色剂：、滴加显色剂：v如如DAB，室温，室温，5min左右。左右。v注意：光镜下掌握染色时间；注意：光镜下掌握染色时间；v流水冲洗流水冲洗 5min采用的方法不同，底物有一定差异采用的方法不同，

19、底物有一定差异.后面详细分析1 1、滴加显色剂：采用的方法不同，底物有一定差异.后面详细分苏木素复染（细胞核苏木素复染（细胞核0.1%盐酸盐酸-乙醇溶液分化乙醇溶液分化13.“成片成片”流水充分冲洗流水充分冲洗梯度酒精脱水梯度酒精脱水中性树胶固定，封片，晾干后镜检。中性树胶固定，封片，晾干后镜检。苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化1 3.“成片”流v结果判读要考虑以下几个方面结果判读要考虑以下几个方面v A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间质质v B、阳性细胞数、阳性细胞数v C、染色强度、染色强度最后一步：结果判读最后一步：

20、结果判读结果判读要考虑以下几个方面最后一步：结果判读光学显微镜下结果判断判读举例：光学显微镜下结果判断判读举例：食管鳞状细胞癌食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳性蛋白强阳性表达，表达位置：细胞质表达，表达位置：细胞质乳腺癌，癌细胞核内乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达强阳性表达光学显微镜下结果判断判读举例：食管鳞状细胞癌 C D 4 4 蛋白强在有转移的在有转移的HCC中，中，VEGF呈强阳性表呈强阳性表达达 ABC 200人甲状腺癌人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，染色，胞膜阳性，SP法，法，DAB染色染色在有转移的H C C 中，V E G F 呈强阳性表达 A B C 2 0 0 人AB

21、C法抗生物素抗生物素-生物素免疫染色法生物素免疫染色法理论基础：卵白素：亦程抗生物素，亲和素。有四个同生物素亲和力极高的结合点。生物素：即机体内维生素H。1.可以与卵白素高亲和力结合；2.可以和抗体IgG的Fc段结合，但不影响抗体活性；3.活化后可与过氧化物酶等结合，也不影响酶活性ABC试剂盒ABC试剂盒1.封闭用血清3.A试剂：卵白素（抗生物素）4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物A B C 法抗生物素-生物素免疫染色法理论基础：生物素：即机体内Biotinylated second antibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimary anti

22、bodyIllustration of ABC methodAvidin-biotin-peroxidase complexB i o t i n y l a t e d s e c o n d a n t i b o d y P-sp法基本原理与基本原理与ABC法相似，但与法相似，但与ABC法稍有不同：法稍有不同：是采用生物素标记的第二抗体与是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原定细胞和组织中的抗原s p 法基本原理与A B C 法相似，但与A B C 法稍有不同：AgAgBio

23、tinStreptavidinEnzyme:HRP or APPrimary antibodyBiotinylated secondary antibodyIllustration of SP methodSP complexA g A g B i o t i n S t r e p t a v i d i n E n z y me:EnVison系统染色原理系统染色原理II抗多聚螯合物酶形成多聚螯合物含有大量酶和II抗分子放大效果好背景着色极浅 E n V i s o n 系统染色原理I I 抗多聚螯合物酶形成多聚螯AgAgPrimary antibodySecondary antibody

24、Enzyme,AP or HRPIllustration of EnVision methodA g A g P r i ma r y a n t i b o d y S e c o n d a r y 小复习：小复习：组织内抗原组织内抗原酶标II抗特异性I抗显色剂显色剂小复习：组织内抗原酶标I I 抗特异性I 抗显色剂 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）v用于鉴别肿瘤的组织来源用于鉴别肿瘤的组织来源v细胞受体检测细胞受体检测v病毒性抗原检测病毒性抗原检测v癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测v重新认识某些肿瘤的组织发生

25、、发病机制重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）用于鉴别肿瘤的组织器官或组织特异性抗原标记物 l前列腺标记物：前列腺标记物：PSA PSA，PSAP PSAP，PSMAPSMA，P504sP504sl甲状腺标记物：甲状腺标记物：TGTG，CTCT，TTF-1TTF-1l甲状旁腺：甲状旁腺：PTHPTHl黑色素细胞标记物：黑色素细胞标记物：MB45MB45，S100S100，MelanAMelanAl肺腺癌的标记物：肺腺癌的标记物：TTF-1TTF-1，SP-ASP-A和和B B，Napsin A Napsin Al肝细胞癌标记物：肝细胞癌标记物：Hep-1

26、Hep-1l乳腺：乳腺：Mammaglobio Mammaglobio，GCDFP15GCDFP15l结肠：结肠：CDX2 CDX2，B-cateninB-cateninl宫颈癌：宫颈癌：P16P16器官或组织特异性抗原标记物 前列腺标记物：P S A，P S A癌可能的起源v较常见的临床情况：较常见的临床情况：淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转移还是新的肺原发性肿瘤？癌可能的起源较常见的临床情况：卵巢腺癌：原发还是肠起源?卵巢起源肠起源CK7+CK20(但常会黏液腺癌阳性

27、表达)+CDX-2(但黏液型可以阳性)+卵巢腺癌：原发还是肠起源?卵巢起源肠起源C K 7+C K 2 0 病原体的标记 vEBVEBVvHPVHPVvHBsAg HBsAg 和和HBCAgHBCAgvMCV MCV 病原体的标记 E B V举一反三举一反三 融会贯通（了解）融会贯通（了解）小拓展小拓展-免疫组织化学（酶联免疫组织化学）免疫组织化学（酶联免疫组织化学）的延伸：的延伸：v荧光标记荧光标记-荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学v血清中抗原检测血清中抗原检测-酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（Elisa试验）试验）v将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测（蛋白印记）（蛋白印记）-免疫印记技术（免疫印记技术（Western-blot）举一反三 融会贯通（了解）小拓展-免疫组织化学（酶联免疫汇报结束谢谢大家!请各位批评指正