免疫学检测技术课件.ppt

1、 免疫学检测技术免疫学检测技术1免疫学检测的要求免疫学检测的要求 特异性：特异性：Ag-AbAg-Ab 灵敏性：患者阳性可能性灵敏性：患者阳性可能性 检测手段检测手段 手工半自动全自动手工半自动全自动2(一一)特异性特异性(二二)可逆性可逆性(三三)可见性（比例性）可见性（比例性）(四四)阶段性阶段性3反应物自身因素反应物自身因素环环 境境 因因 素素抗原的理化性状、分子量、抗原表位种类、数目抗原的理化性状、分子量、抗原表位种类、数目等有关。等有关。抗体的来源、特异性、亲和力及与抗原的比例关抗体的来源、特异性、亲和力及与抗原的比例关系等。系等。电解质：电解质：抗原抗原-抗体反应通常应用抗体反应

2、通常应用0.85%0.85%的氯化钠的氯化钠作为稀释液，以供给适当浓度的电解质。作为稀释液，以供给适当浓度的电解质。温度：温度：一般反应在一般反应在37C37C水浴或孵育箱中进行。水浴或孵育箱中进行。酸碱度：酸碱度：抗原抗原-抗体反应适应的酸碱度为抗体反应适应的酸碱度为PH68PH68。其它其它：如物理振荡等。：如物理振荡等。45（一）凝集反应一）凝集反应 直接凝集反应直接凝集反应 间接凝集反应间接凝集反应 6直接凝集直接凝集（一）凝集反应一）凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电介质参与细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电介质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝下，直接与相应抗体结合

3、，出现肉眼可见的凝集现象。集现象。玻片凝集（定性）玻片凝集（定性）试管凝集（定量）试管凝集（定量）7（一）凝集反应一）凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在颗粒性载将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）反应。在适当电介体表面，然后与相应抗体（或抗原）反应。在适当电介质参与下，出现凝集现象。包括质参与下，出现凝集现象。包括正向正向间接凝集反应、反间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。Coombs试验试验间接凝集抑制反应间接凝集抑制反应+协同凝集协同凝集8（一）沉淀反应一）沉淀反

4、应 PrecipitationPrecipitation910对流免疫电泳对流免疫电泳：双向免疫扩散电泳双向免疫扩散电泳11免疫电泳免疫电泳12免疫浊度分析技术免疫浊度分析技术透射免疫比浊透射免疫比浊：抗体固定，加入抗原量越多，抗体固定，加入抗原量越多，IC形成越多，形成越多，液体的吸光度越大。液体的吸光度越大。散射免疫比浊散射免疫比浊：激光照射液体中激光照射液体中IC时，光线发生散射，测时，光线发生散射，测量散射光强度可知待测抗原量。量散射光强度可知待测抗原量。终点散射比浊法终点散射比浊法：测免疫反应进行到一定时间时的测免疫反应进行到一定时间时的IC的散射信号值。的散射信号值。速率散射比浊法

5、速率散射比浊法：测单位时间内测单位时间内IC形成的最快时间段散射信号值。形成的最快时间段散射信号值。13标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原（三）免疫标记技术三）免疫标记技术14（三）免疫标记技术三）免疫标记技术酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验BAS-ELISA BAS-ELISA 酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISPOT)ELISPOT)酶免疫组化法酶免疫组化法 15n间接法间接法 (测抗体）测抗体）n双抗夹心法双抗夹心法（测抗原）（测抗原）n抗原竞争法抗原竞争法（测抗原）（测抗原）nIgMIgM捕获法捕获法（测抗体）（测抗体）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme l

6、inked immunosorbent assay,ELISAenzyme linked immunosorbent assay,ELISA法）法）E:E:辣根过氧化酶辣根过氧化酶 HRPHRPS:S:底物底物 四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMBTMB）/邻苯二胺邻苯二胺16间间 接接 法法双抗夹心法双抗夹心法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISAenzyme linked immunosorbent assay,ELISA法）法）17抗原竞争法抗原竞争法E+E+试验组EEEE+对照组酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（e

7、nzyme linked immunosorbent assay,ELISAenzyme linked immunosorbent assay,ELISA法）法）18IgMIgM捕捉法捕捉法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISAenzyme linked immunosorbent assay,ELISA法）法）19酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISAPOTELISAPOT）20EEEEEE酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISAPOTELISAPOT）21BAS-ELISABAS-ELISA 22BAS

8、-ELISABAS-ELISA BA法EEEEEEBAB法ABC法EEEEEEEEEEEE23荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术2425（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术26放射免疫分析放射免疫分析27（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术28 能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIVHIV抗体的抗体的检测。检测。（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术2930 玻璃黏附法玻璃黏附法 （分离单核细胞和淋巴细胞）（分离单核细胞和淋巴细胞）尼龙毛分

9、离法尼龙毛分离法 （分离（分离B B细胞和细胞和T T细胞）细胞）E E花结分离法花结分离法 (分离分离T T细胞和细胞和B B细胞）细胞）补体细胞毒法补体细胞毒法（分离抗原阳性和阴性细胞）（分离抗原阳性和阴性细胞）免疫吸附分离法免疫吸附分离法 （分离（分离CD4+TCD4+T和和CD8+T)CD8+T)免疫磁珠法免疫磁珠法 （分离（分离T T亚群）亚群）流式细胞术等等流式细胞术等等 （细胞类型和数量）（细胞类型和数量）31 荧光染色的细胞悬液和鞘液混合 N2压力 流室（形成鞘包悬液的层流）喷嘴高速喷下 光光 源源 极光束交会 散射光散射光监测器 计算机计算机分析处理 荧光荧光监测器 获得细胞

10、类型数量信息 高频震荡器高频震荡器 细胞分离提纯系统细胞分离提纯系统 输出 极向偏转板极向偏转板 分析鉴别 带不同电荷的不同类的细胞在电磁场中偏离 收集于不同容器中流式细胞术流式细胞术32流式细胞仪分选技术原理示意图流式细胞仪分选技术原理示意图33磁珠分离法磁珠分离法 将已知抗细胞表面标记将已知抗细胞表面标记(如如CD4CD4）的）的AbAb交联于微珠，交联于微珠，与细胞悬液反应后，微珠借与细胞悬液反应后，微珠借AbAb结合于相应细胞群结合于相应细胞群或亚群表面。再将细胞悬液加于一柱内，并置磁或亚群表面。再将细胞悬液加于一柱内，并置磁场中，因微珠被磁场吸引，将磁珠结合的细胞与场中，因微珠被磁场

11、吸引，将磁珠结合的细胞与磁珠非结合细胞分开。从而获得磁珠非结合细胞分开。从而获得CDCD4 4+T T细胞。细胞。34前臂前臂5U5U，48487272小时，红小时，红肿硬结肿硬结5mm5mm为阳性。为阳性。35SRBC+SRBC+待检待检B B细胞细胞+补体补体+琼脂糖液琼脂糖液倾注平皿倾注平皿温育温育1-31-3小时小时：检测检测B B细胞产生抗体的能力细胞产生抗体的能力36 测具有细胞毒作用的淋巴细胞的活性。测具有细胞毒作用的淋巴细胞的活性。371 1 中性粒细胞趋化功能测定中性粒细胞趋化功能测定 1 1）滤膜渗透法）滤膜渗透法 2 2）琼脂糖平板法）琼脂糖平板法2 2 中性粒细胞吞噬功能测定中性粒细胞吞噬功能测定 1 1）显微镜检查法）显微镜检查法 2 2）硝基蓝四氮唑试验）硝基蓝四氮唑试验 3 3）荧光标记试验）荧光标记试验3 3 单核单核-巨噬细胞功能检测巨噬细胞功能检测 1 1）炭粒廓清试验）炭粒廓清试验 2 2）吞噬功能检测）吞噬功能检测381 Southern 1 Southern 印迹杂交印迹杂交2 2 斑点印迹杂交斑点印迹杂交3 3 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR)PCR)4 4原位杂交和原位原位杂交和原位PCRPCR5 5 荧光定量荧光定量PCRPCR3940