细胞染色体显示和分带技术示范课件.ppt

1、细胞染色体显示和分带技术（优选）细胞染色体显示和分（优选）细胞染色体显示和分带技术带技术一、X染色质显示法 女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色 结果细胞质不着色，细胞核染成紫红色，核内Barr 小体呈三角形/半月形。二、Y染色质显示法 男性Y染色质 盐酸阿的平染色法 结果Y染色质呈特别明亮的黄绿色荧光园点，可位于核内任何位置，但多见于中央部位，第二节 培养细胞染色体显示法 一、原理一、原理 显示染色体要选择分裂中期细胞，因细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。获得多量的中期分裂相及染色体分散均匀的理

2、想分裂相可采取的措施如下:1提高细胞分裂相数提高细胞分裂相数（1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞应选择对数生长期的细胞。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。（2）阻抑中期分裂 用秋水仙素(Colchicine)，现常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)来破坏细胞有丝分裂中的纺锤丝，以发挥阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并无干扰，因此随时间延长可截获很多中期分裂相，一般的用量秋水仙素0.040.8mg/L培养液，秋水仙胺0.0040.08mg/L培养液。作用时间为26小时。2促染色体分散措施促染色体分散措施（1）低渗处理 一般用0.075mol/L，在37水浴中将上述细

3、胞处理2040分钟，可使细胞体积胀大，染色体松散。（2）固定 常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用时现用现配。显示染色体方法很多，以下几种方法较为常用。二、传代细胞染色体检查二、传代细胞染色体检查 一、原理秋水仙碱可使细胞停止在分裂中期，染色体长短恰倒好处。二、方法 细胞类型传代细胞系，外周血LC，羊水，绒毛细胞等 方法秋水仙素 低渗固定染色镜检末梢血培养法，Giemsa染色法显示人染色体第三节第三节 染色体结构显示和检染色体结构显示和检测测 一、染色体显带原理和种类一、染色体显带原理和种类 二、染色体显带方法要点二、染色体显带方法要点 三、原理三、原理 四、四、常用染色体显带法常用染色体显带法

4、五、姐妹染色单体分化染色五、姐妹染色单体分化染色一、染色体显带原理和种类（一）原理 染色体显带是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近2000个G带。（二）种类 染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同的横纹。根据显带方法不同可分为用奎吖因(QM)、阿的平(QD)荧光染色的带，称“Q”带；用Giemsa染

5、色显带称“G”带；用Giemsa染色显示异染色质部分称“C”带；用特殊方法处理后，显现出与Q带和G带相反的带型称“K”带等。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。二、染色体显带方法要点二、染色体显带方法要点“老化”处理将染色体制片后存放310分钟或86干燥2030分钟 显Q带法用奎吖因(QM)或阿的平(QM)染色显带 Giemsa显G带胰酶消化 Giemsa染色显带 显C带法 在预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟 Giemsa染色15分钟显带 注意1、标本片老化处理很重要；2、胰酶浓度和消化时间要事先熟知，消化要充分但不能过度；3、中期分裂相要多而均匀，稍长一些为佳1中期

6、染色体 为了获得满意的显带效果，需制备质量好的中期染色体标本，即须达到以下要求长度适宜，一般稍长一些，能显出更多的条带，这与加入秋水仙素的浓度和作用时间有关，要控制好。染色体分散均匀无重叠，这与低渗有关，低渗不足染色体易发生重叠，过度易流失。无严重单体分叉。2特殊处理 中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤（1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以310天为宜。（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。常用80干燥2030分钟。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。2促染色体分散措施25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用G

7、iemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。（1）低渗处理 一般用0.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。男性Y染色质 盐酸阿的平染色法(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸

8、腺嘧啶核苷(Thymidine.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。制片细胞培养时加入BUdR，淋巴细胞于37培养4872小时后加秋水仙碱按染色体常规制片法制片。二、传代细胞染色体检查二、染色体显带方法要点8)，56温浴10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色方法秋水仙素 低渗固定染色镜检显Q带法用奎吖因(QM)或阿的平(QM)染色显带预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单

9、易行，效果好。细胞染色体显示和分带技术三、常用染色体显带法 1显Q带法 （1）将标本片于pH6.0缓冲液中浸510分钟后，再转浸入用Soresen氏缓冲液(pH6.0)配制的0.2%的QD或QM染液中染色510分钟(见表1231)。（2）用pH6.0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。（3）在荧光显微镜下观察。表表12-3-1 Soresen(100ml)缓冲液缓冲液PHPHNaNa2 2HPOHPO4 4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2POPO4 4(1/15m0l/(1/15m0l/L)L)pHpHNaNa2 2HPOHPO4

10、4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2HPOHPO4 4(1/15m(1/15mol/L)ol/L)5.295.292.52.597.597.56.816.81505050505.595.595 595956.986.98606040405.915.91101090907.177.17707030306.246.24202080807.387.38808020206.476.47363674747.737.73909010106.646.64404060608.048.0495955 52胰酶一Giemsa显G带法(1)将中期染色体标本于6080烘箱中烘24小时或过夜，然

11、后再浸入0.025m磷酸缓冲液中(pH6.8)，56温浴10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。3显C带法 将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.4磷

12、酸冲液，用Giemsa染色15分钟后镜检。5%Ba(OH)2称Ba(OH)22.5g溶于50mL生理盐水中。必须注意胰蛋白酶消化显带过程中，消化不足，带不出现。消化过度，染色体变得膨胀和不着色。要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单易行，效果好。（见书后照片6）末梢血培养法，Giemsa染色分带法显示人染色体人染色体G带慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞PH染色体核型四、姐妹染色单体分化染色(一)原理 细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.TdR)进

13、入细胞增殖周期，第一周期每条染色单体DNA双链都被BUdR掺入(TB、TB)，第二周期只有一条单体保留了无BUdR旧链，另一条单体双链都有BUdR(TB、TB)，经荧光染料着色时TB有强荧光，BB荧光弱。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。染色（1）Giemsa染色（2）用荧光染料Hoechst33258染色女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或

14、半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.细胞染色体显示和分带技术（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。（优选）细胞染色体显示和分带技术男性Y染色质 盐酸阿的平染色法消化过度，染色体变得膨胀和不着色。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带

15、(Negative Band)。第三节 染色体结构显示和检测（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。二、染色体显带方法要点方法秋水仙素 低渗固定染色镜检（1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以310天为宜。男性Y染色质 盐酸阿的平染色法2%的QD或QM染液中染色510分钟(见表1231)。要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。（1）低渗处理 一般用0.将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.根据显带方法不同可分为用奎吖因(QM)、阿的平(

16、QD)荧光染色的带，称“Q”带；细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近2000个G带。二、染色体显带方法要点（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆

17、动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。方法秋水仙素 低渗固定染色镜检（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。一、染色体显带原理和种类025m磷酸缓冲液中(pH6.(二)方法(二)方法 1.制片细胞培养时加入BUdR，淋巴细胞于37培养4872小时后加秋水仙碱按染色体常规制片法制片。染色（1）Giemsa染色（2）用荧光染料Hoechst33258染色 镜检一条单染色体着色强（或有强荧光），另一条着色淡（或有弱荧光）