第十二章机体免疫功能的检测技术课件.ppt

1、第十二章机体免疫功能的检测技术一、一、白细胞的分离白细胞的分离二、二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离三、三、淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离 四、四、其他细胞的分离和收集其他细胞的分离和收集 返回1自然沉降分离法2聚合物加速沉淀法返回一、白细胞的分离血液中红细胞与白细胞比例约6001000:1 上层淡黄色血浆灰白层白细胞底层红细胞返回1自然沉降分离法室温静置30-60min2聚合物加速沉淀法返回 某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。1.Ficoll分层液法2.Percoll分层液法

2、二、外周血单个核细胞的分离二、外周血单个核细胞的分离返回人外周血细胞的密度为：红细胞 1.093，粒细胞 1.092，单个核细胞1.0751.090，血小板 1.0301.035。1.Ficoll分层液法 Ficoll分层液法即聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心分离法（ficollhypaque density gradient centrifugation)聚蔗糖密度1.020 泛影葡胺密度1.200 外周血单个核细胞（PBMC）密度 人1.077 小鼠1.088 马1.090用Ficoll分离外周血单个核细胞返回95%2000rpm20min2.Percoll分层液法 Percoll是聚乙烯吡咯烷

3、酮包被的硅胶混悬液的商品名，为一种无细胞毒无刺激的新型密度梯度分层液。Percoll原液（密度1.135）+8.5%NaCl或1.5M PBS (9:1)Percoll 浓度（%）70 60 50 40 30 20 比重（g/ml)1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031用Percoll分离外周血单个核细胞返回75%98%血小板血小板三、淋巴细胞及其亚群的分离三、淋巴细胞及其亚群的分离1.红细胞的去除2.血小板的去除3.单核细胞的去除4.淋巴细胞亚群的分离返回1.红细胞的去除（1）低渗裂解法：蒸馏水（2）氯化铵处理法：0.83%氯化铵返回PBMC+1ml H2O轻

4、轻振摇不超过1min加入等量1.8%生理盐水去除红细胞碎片3.单核细胞的去除（1）粘附贴壁法：在玻璃或塑料平皿中于37温箱静置1h 玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞（2）吸附柱过滤法：单核细胞37 1-2h淋巴细胞刺激指数(SI)=刺激孔cpm/对照孔cpmBFA阻滞细胞因子释放杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏吞噬红细胞的巨噬细胞数50%为降低嗜中性粒细胞趋化功能检测B细胞+刺激物（PWM，LPS）巨噬细胞表面受体的检测玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞（5）免疫磁珠分离法50%为降低二、外周血单个核细胞的分离实验孔OD值-自发释放孔OD值（1）单相免疫扩散试

5、验NK细胞和LAK细胞功能的检测三、淋巴细胞及其亚群的分离LAK细胞的靶细胞：LiBr用Ficoll分离外周血单个核细胞轻轻振摇不超过1min后，诱导产生的一类新型杀伤细胞（3）磁铁吸引法：加入直径为3um的羰基铁颗粒，待单核细胞充分吞噬颗粒后，再用磁铁将单核细胞吸至管底，上层液中则含有较纯的淋巴细胞。返回4.淋巴细胞亚群的分离（1）E-玫瑰花环沉降法（2）尼龙棉纤维分离法（3）亲和分离法（4）抗体/补体介导的特异性细胞 毒作用分离法（5）免疫磁珠分离法（6）流式细胞仪分离法返回（1）E-玫瑰花环沉降法返回（2）尼龙棉纤维分离法T细胞：不吸附B细胞：吸附T细胞(90%)B细胞(80%)37 1

6、-2h返回10-20%小牛血清培养液（3）亲和分离法返回（4）抗体/补体介导的特异性 细胞毒作用分离法返回 在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。这是一种负选性分离法，简称细胞毒法。（5）免疫磁珠分离法PBMC+生物素标记抗体+亲和素标记磁珠 CD56 MicroBeads:positive selection NK Cell Isolation Kit:negative selection分离前分离后BrdUPBMCNK-depleted PBMC17.6%41%返回返回（6）流式细胞仪分离法四、其他细胞的分离和收集（一）巨噬细胞的分离和收集（二）NK细胞

7、细胞的分离返回（一）吞噬细胞的分离和收集u 人：组织液（斑蝥敷贴法）滤纸蘸取10%中药斑蝥酒精浸出液臂内侧皮肤48小时后局部形成水疱吸取疱中的组织液,内含巨噬细胞实验孔cpm-自发释放孔cpmB细胞+刺激物（PWM，LPS）人外周血细胞的密度为：红细胞 1.某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。用Percoll分离外周血单个核细胞巨噬细胞功能的检测转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小评价标准：60-80%为正常，LAK细胞的靶细胞：LiBr轻轻振摇不超过1min比重（g/ml)1.三、淋巴细

8、胞及其亚群的分离在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小 外周血单个核细胞（PBMC）密度 外周血单个核细胞（PBMC）密度一、免疫球蛋白的定量检测第十二章机体免疫功能的检测技术一、免疫球蛋白的定量检测四、其他细胞的分离和收集杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏返回u 小动物：腹腔巨噬细胞小鼠腹腔内注入石蜡油天后吸出腹腔浸出液7080%为巨噬细胞（二）NK细胞的分离单核细胞:粘附法B细胞:尼仑棉纤维T细胞:E-玫瑰花环沉降法返回PBMCNK一、免疫球蛋白的定量检测二、B细胞数目及功能的检测返回一、免疫球蛋白的定量检测返

9、回（1）单相免疫扩散试验（2）双相免疫扩散试验（3）火箭电泳（4）中和反应（5）ELISA返回FLASH返回FLASH返回血清抗体病毒接种细胞或鸡胚计算半数保护率（PD50）返回返回巨噬细胞功能的检测评价标准：60-80%为正常，实验孔cpm-自发释放孔cpm轻轻振摇不超过1min 外周血单个核细胞（PBMC）密度（1）低渗裂解法：蒸馏水第四节 细胞因子及其受体的检测技术外周血B细胞功能的检测（二）NK细胞细胞的分离一、细胞因子测定的基本原理及方法毒作用分离法外周血B细胞数目的检测LAK细胞的靶细胞：LiBr（一）吞噬细胞的分离和收集单个细胞产生细胞因子的测定技术（ELISPOT,反向溶血空斑

10、试验）实验孔OD值-自发释放孔OD值玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附单核细胞，收集未吸附的淋巴细胞24h后收集细胞于玻璃纤维滤膜二、B细胞数目及功能的检测1.外周血B细胞数目的检测2.外周血B细胞功能的检测返回1.外周血B细胞数目的检测 免疫荧光技术 花环试验返回荧光显微镜返回CD19CD3流式细胞仪 B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图 返回2.外周血B细胞功能的检测 B细胞非特异性增殖 抗体产生能力返回返回B细胞+刺激物（PWM，LPS）酶联免疫斑点试验返回一、一、T细胞亚群和数目的检测细胞亚群和数目的检测二、二、T细胞功能的检测细胞功能的检测三、三、其他免疫细胞功能的检测其他免疫细胞功能的检测返

11、回一、一、T细胞亚群和数目的检测细胞亚群和数目的检测2.免疫荧光技术1.花环试验3.免疫酶细胞技术返回返回玫瑰花环试验正常范围:60-80%E-花环形成率=形成花环的淋巴细胞数淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)荧光显微镜返回流式细胞仪二、二、T细胞功能的检测细胞功能的检测（一）体外功能实验（二）体内功能实验返回（一）体外功能实验（一）体外功能实验1.淋巴细胞增殖试验2.细胞毒试验返回 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞凋亡检测法1.淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物（PHA、ConA）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法形态学计数法转化细胞：体积大

12、，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小未转化细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大转化率=转化细胞数/淋巴细胞总数评价标准：60-80%为正常，50-59%为偏低，2MTT法u 3-4,4-二甲基噻唑2，5二苯基四氮唑溴盐，简称MTT；u 线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，经盐酸异丙醇溶解后为蓝色溶液；u 比色测定间接反映活细胞数量。返回刺激指数(SI)=刺激孔OD值/对照孔OD值51Cr释放法释放法杀伤率（%）=实验孔cpm-自发释放孔cpm最大释放孔cpm-自发释放孔cpm100返回返回乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（LDH）释放法释放法CTL+靶细胞释放LDH碘硝基氯化四

13、氮唑（INT）红色甲臜（farmazan）比活性测定（OD值）杀伤率（%）=实验孔OD值-自发释放孔OD值最大释放孔OD值-自发释放孔OD值100靶细胞细胞凋亡检测杀伤率%=（靶细胞对照孔细胞数-共培养孔靶细胞数）/靶细胞对照孔细胞数100%效应细胞+靶细胞细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法返回三、其他免疫细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测3.NK细胞和细胞和LAK细胞功能的检测细胞功能的检测返回2.嗜中性粒细胞功能的检测嗜中性粒细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测 炭粒廓清试验 吞噬功能的检测 巨噬细胞表面受体的检测炭粒廓清试验炭粒廓

14、清试验小鼠静脉注射炭粒悬液测定血中炭粒的浓度血液中炭粒被廓清的速度巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测吞噬指数=吞噬红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数 100%吞噬红细胞的总数 计数的巨噬细胞数37保温0.51h 返回 巨噬细胞巨噬细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图玫瑰花环形成示意图 MM 炎症反应的过程炎症反应的过程红、肿、热、痛嗜中性粒细胞趋化功能检测嗜中性粒细胞趋化功能检测返回u 外周血淋巴细胞在体外经过IL-2培养 后，诱导产生的一类新型杀伤细胞u 杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏u 不受MHC限制性，无特异性LAK（lymphokine activated killer cells）NK细胞

15、和细胞和LAK细胞功能的检测细胞功能的检测NK细胞的靶细胞：K562LAK细胞的靶细胞：LiBr返回皮肤试验皮肤试验返回第四节第四节 细胞因子细胞因子及其及其受体受体的检测技术的检测技术一、一、细胞因子测定的基本原理及方法细胞因子测定的基本原理及方法二、二、细胞因子受体测定的基本原理及方法细胞因子受体测定的基本原理及方法返回返回返回一、细胞因子测定的基本原理及方法一、细胞因子测定的基本原理及方法1.生物活性检测技术（生物活性检测技术（依赖性细胞株依赖性细胞株、功能测定功能测定等）等）2.免疫学检测技术（免疫学检测技术（ELISA、RIA、FACS）3.分子生物学技术（分子杂交技术、分子生物学技术（分子杂交技术、PCR）4.单个细胞产生细胞因子的测定技术单个细胞产生细胞因子的测定技术（ELISPOT,反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验）返回返回返回TNF-Control细胞内细胞因子染色法细胞内细胞因子染色法（intracellular cytokine staining）BFA阻滞细胞因子释放细胞的固定和破膜荧光抗体染色流式细胞仪检测PMA+Inomycin刺激细胞