正常和肿瘤组织细胞的培养培训课件.ppt
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- 正常 肿瘤 组织细胞 培养 培训 课件
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1、正常和肿瘤组织细胞正常和肿瘤组织细胞的培养的培养2正常和肿瘤组织细胞的培养 不同组织细胞和器官的结构和功能、生不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同,在体外培养中所需的分离方长特性不同,在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。法和生长条件也不同。3正常和肿瘤组织细胞的培养许多器官上的上皮细胞具有特定的功能,如肾和肠道上皮细许多器官上的上皮细胞具有特定的功能,如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能,肝和胰上皮细胞的分泌功能,肺上皮细胞胞具有吸收功能,肝和胰上皮细胞的分泌功能,肺上皮细胞的气体交换功能;的气体交换功能;上皮组织还常发生肿瘤。上皮组织还常发生肿瘤。4正常和肿瘤组织细胞的培养 1.上
2、皮组织的形态结构上皮组织的形态结构 群体依赖性(群体依赖性(population dependence)接触抑制(接触抑制(contact inhibition)2.上皮细胞的极性上皮细胞的极性 贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞-贴壁生长贴壁生长 生长基质生长基质 3.上皮细胞间的连接上皮细胞间的连接5正常和肿瘤组织细胞的培养1.形态学结构:形态学结构:均质性、透明性很强,结构不明显均质性、透明性很强,结构不明显6正常和肿瘤组织细胞的培养(1)体外培养的特殊条件:体外培养的特殊条件:l 防范微生物污染防范微生物污染l 生长基质的支持生长基质的支持l 特殊的培养基特殊的培养基 M199 RPMI16
3、40 DMEM Fam F12 无血清培养基无血清培养基l 去成纤维细胞去成纤维细胞7正常和肿瘤组织细胞的培养根据上皮组织分布的特性,位于体表或衬贴消化道、根据上皮组织分布的特性,位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织,直接暴露或同外环境相接触,呼吸道内等处的上皮组织,直接暴露或同外环境相接触,组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌;分离、种植、培养等诸多操作要求在组织取材时就严格灭菌;分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使
4、用的各种液体,包括细胞培养中所使用的各种液体,包括细胞保存液、分离液保存液、分离液以及以及培养基培养基等需添加等需添加抗生素抗生素,抗生素抗生素浓度比其它组织培养高。浓度比其它组织培养高。防范微生物污染防范微生物污染8正常和肿瘤组织细胞的培养皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长,即所谓的皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长,即所谓的贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质,如胶原或其它细胞外基在培养器皿表面包被生长基质,如胶原或其它细胞外基质成分等,模拟体内的基膜结构,不仅特别有利于上皮质成分等,模拟体内的基膜结构,不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长,也有利于培养细胞的分化使
5、细胞细胞的贴附和生长,也有利于培养细胞的分化使细胞极性表现更为明显。极性表现更为明显。生长基质的支持生长基质的支持9正常和肿瘤组织细胞的培养M199和和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存,对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。其生存,对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。DMEM和和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附;维持上皮细胞在体外培养状态的分化。可促进上皮细胞的贴附;维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细
6、胞的培养,培养基培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养,培养基成分中添加微量元素的无机离子,更加利于细胞的生长和代谢。成分中添加微量元素的无机离子,更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时,将在实际培养时,将DMEM与与HamFl2按一定比例混合用于上皮组按一定比例混合用于上皮组织培养。织培养。特殊的培养基特殊的培养基10正常和肿瘤组织细胞的培养去除成纤维细胞去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分,常常造成成纤维细胞与上皮会带入少量结缔组织成分,常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有
7、增殖能力和粘附能细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点,很容易力强的特点,很容易“疯长疯长”为培养物中的优势细胞群,为培养物中的优势细胞群,从而干扰或抑制上皮细胞的生长,成为上皮细胞的从而干扰或抑制上皮细胞的生长,成为上皮细胞的“细胞污染源细胞污染源”。因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中,要特别注意上皮细胞的纯化,去除和抑制成纤维细中,要特别注意上皮细胞的纯化,去除和抑制成纤维细胞的生长。胞的生长。11正常和肿瘤组织细胞的培养12正常和肿瘤组织细胞的培养1.一般形态学观察一般形态学观察 光镜:光镜:形态、轮廓、
8、生长情况等。形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜:电镜:桥粒、形态结构特征、细胞间关系桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液培养液pH变化:变化:颜色变化?颜色变化?培养物的污染情况:培养物的污染情况:透明度变化?透明度变化?13正常和肿瘤组织细胞的培养2.组织化学与免疫组织化学观察与检测组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类:酶类:碱性磷酸酶碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物:特异性抗原标记物:角蛋白、上皮细胞膜抗原角蛋白、上皮细胞膜抗原 VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白14正常和肿瘤
9、组织细胞的培养15正常和肿瘤组织细胞的培养组织来源:组织来源:婴儿脐带婴儿脐带培养用液:培养用液:M199+20%FCS D-Hanks 0.1%胶原酶溶液胶原酶溶液1.主要材料:主要材料:16正常和肿瘤组织细胞的培养2.培养方法:培养方法:分离细胞培养法17正常和肿瘤组织细胞的培养1).将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。(注:4下最多贮存24小时,室温下不超过6小时,否则废弃)2).用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中,用无菌的PBS溶液冲洗3-5次,将污血冲洗干净为止。3).用手术钳夹紧脐带下端,加入15ml 的胶原酶(1mg/ml)室温下消化15-20分钟,并不时上下
10、摇动脐带。4).消化完后,将下端手术钳松开,消化液流入一个50 ml无菌离心管中,用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。5).将收集液离心(2000转/分)3分钟,去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置CO2培养箱中培养,两至三天可见细胞长成单层。18正常和肿瘤组织细胞的培养 (1)关于接种材料的制备关于接种材料的制备 取材与消化取材与消化 消化酶、浓度、时间消化酶、浓度、时间 (2)排除成纤维细胞排除成纤维细胞 传代去除法传代去除法 加肝素培养法加肝素培养法(90u/ml)刮除法刮除法 (3)关于培养液关于培养液 (4)关于传代培养关于传代培养5.讨论:19正常和
11、肿瘤组织细胞的培养 (1)光镜检查光镜检查 (2)透射电镜检查:透射电镜检查:W-P小体小体 (3)VIII因子相关抗原的免疫组化检测因子相关抗原的免疫组化检测6.内皮细胞的鉴定:内皮细胞的鉴定:20正常和肿瘤组织细胞的培养21正常和肿瘤组织细胞的培养1.主要材料:主要材料:a.细胞来源:细胞来源:b.无血清培养液:无血清培养液:基础培养液:基础培养液:DMEM/HamF12(1:1)添加物:添加物:胰岛素胰岛素 5 g/ml 转铁蛋白转铁蛋白5 g/ml 硒硒 5 g/ml 氢化可的松氢化可的松36ng/ml T3 4 ng/ml EGF 10 g/ml22正常和肿瘤组织细胞的培养 c.消化
12、液:消化液:0.2%胰蛋白酶胰蛋白酶d.细胞筛网:细胞筛网:80和和100目目23正常和肿瘤组织细胞的培养2.原代培养:原代培养:切取切取1cm3外层肾皮质、剪碎成外层肾皮质、剪碎成1mm3 80目研磨冲洗、于目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段目上收集肾小管节段0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养每隔每隔34天,更换培养液天,更换培养液24正常和肿瘤组织细胞的培养3.传代培养:传代培养:4.培养结果:培养结果:3d 长出细胞长出细胞 57d 进入对数生长期进入对数生长期 79d 融合成单细胞层融
13、合成单细胞层5.鉴定:鉴定:抗角蛋白抗体染色(抗角蛋白抗体染色(+)25正常和肿瘤组织细胞的培养6.注意事项:注意事项:a.分离方法:分离方法:b.鉴定方法:鉴定方法:26正常和肿瘤组织细胞的培养 巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活23周,多用做原周,多用做原代培养,难以长期生存。代培养,难以长期生存。巨
14、噬细胞也建有无限细胞系,大多巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l,培养中呈巨噬,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法最为实用。腹腔取材法最为实用。27正常和肿瘤组织细胞的培养1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。入肠内!),以刺流
15、产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中乙醇中35秒。秒。4、置动物于解剖、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。5、用、用70%酒精擦洗腹膜壁,酒精擦洗腹膜壁,注射器吸注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。壁,使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧
16、使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针、小心拔出针头,把液体注入离心管。头,把液体注入离心管。8、4下下250g离心离心10分钟后,去上清,分钟后,去上清,加加10ml DMEM培养基。培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生、计数细胞。每只鼠可产生20一一30106细胞,其中细胞,其中90%为巨噬细胞。为巨噬细胞。10、以、以3105个贴附细胞个贴附细胞/平方厘米接种。平方厘米接种。11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用白细胞,纯化培养细胞,用DMEM液冲洗液冲洗1一一2次,再加
17、新次,再加新DMEM培养液置培养液置CO2温箱中。温箱中。28正常和肿瘤组织细胞的培养动物:动物:小鼠、大鼠、兔、人小鼠、大鼠、兔、人培养基:培养基:Eagle MEM RPMI1640 HamF12常用的巨噬细胞:常用的巨噬细胞:肺泡和腹腔巨噬细胞肺泡和腹腔巨噬细胞29正常和肿瘤组织细胞的培养(一)肺泡巨噬细胞(一)肺泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法支气管肺泡灌洗法 支气管镜肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法(二)腹腔巨噬细胞(二)腹腔巨噬细胞 1.小鼠腹腔巨噬细胞的获取:小鼠腹腔巨噬细胞的获取:(1)主要材料:主要材料:实验动物实验动物:6周龄小鼠周龄小鼠 培养液:培养液:10%FCS RPMI16
18、40 30正常和肿瘤组织细胞的培养1 1、原理:、原理:巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2.2.方法:方法:用帖壁法纯化巨噬细胞用帖壁法纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞31正常和肿瘤组织细胞的培养1用含用含2040小牛血清的小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配培养液将巨噬细胞配成成21064106/ml的浓度。以每平方厘米的浓度。以每平方厘米21054105个个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿(瓶)或塑料培巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿(瓶)或塑料培养皿(瓶)中。养皿(瓶)中。37 5 CO2培
19、养箱中培养培养箱中培养1小时或小时或24小时。小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞,而小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞,而24小小时可以得到较多的巨噬细胞。时可以得到较多的巨噬细胞。2040的小牛血清可以减少的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。淋巴细胞的粘附。2摇晃培养皿(瓶),悬浮未粘附细胞,吸出细胞悬液。用预摇晃培养皿(瓶),悬浮未粘附细胞,吸出细胞悬液。用预温的温的Hanks液洗涤细胞液洗涤细胞34次。悬浮细胞可重复粘附,得到更次。悬浮细胞可重复粘附,得到更多巨噬细胞。用适量含多巨噬细胞。用适量含2.5mM EDTA的无钙镁的无钙镁Hanks液消化细液消化
20、细胞胞37 1530分钟。用吸管吹打分离细胞,离心分钟。用吸管吹打分离细胞,离心250g 10分钟,分钟,去上清液。去上清液。3用预冷用预冷Hanks液洗涤细胞液洗涤细胞34次,每次离心次,每次离心250g 10 min,去上清。最后用含去上清。最后用含10FBS的的RPMI-1640培养液悬浮细胞,台培养液悬浮细胞,台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力,将细胞配成所需浓度。盼蓝染色计数细胞并测细胞活力,将细胞配成所需浓度。用帖壁法纯化巨噬细胞用帖壁法纯化巨噬细胞 32正常和肿瘤组织细胞的培养1取取15ml离心管,将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上离心管,将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺
21、序依次分层加在离心管中,每个浓度淡的顺序依次分层加在离心管中,每个浓度2ml。最后加上上。最后加上上述巨噬细胞悬液述巨噬细胞悬液35ml(约含(约含21075107细胞)。细胞)。24中,水平离心中,水平离心1000g 30分钟,垂直取出离心管,小心分钟,垂直取出离心管,小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1小牛血清小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞培养液洗涤各交界面细胞2次,每次次,每次200g 10分钟。用含分钟。用含10小牛血清的小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。培养液将细胞配成所需的浓度。用不连续密度梯度离心纯化巨
22、噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 33正常和肿瘤组织细胞的培养(一)主要材料:(一)主要材料:培养液:培养液:RPMI1640 等等+1040%FCS+抗生素抗生素(二)实验步骤:(二)实验步骤:a.冷分离冷分离 b.调整细胞浓度:调整细胞浓度:24106/ml c.接种培养接种培养34正常和肿瘤组织细胞的培养(三)培养结果:(三)培养结果:大大 小:小:2050 m形形 态:态:菱形、星形、圆形菱形、星形、圆形功功 能:能:吞噬功能吞噬功能增殖情况:增殖情况:不增殖、存活不增殖、存活13周周35正常和肿瘤组织细胞的培养(四)巨噬细胞的鉴定(四)巨噬细胞的鉴定1.吞噬实验:吞噬实验:加入
23、加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力试验:抗胰蛋白酶消化能力试验:0.25%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min、再用吸管反复吹打、再用吸管反复吹打 细胞变园但不脱落细胞变园但不脱落3.细胞化学试验:细胞化学试验:ACP酶染色:棕黑色酶染色:棕黑色 NSE酶染色:紫蓝色酶染色:紫蓝色36正常和肿瘤组织细胞的培养37正常和肿瘤组织细胞的培养表面标志:表面标志:1.表面受体:TCR SRBC R Fc R MR Measles viruse RT淋巴细胞:淋巴细胞:38正常和肿瘤组织细胞的培养 MHC CD2.表面抗原39正常和肿瘤组织细胞的培养1.表
24、面受体表面受体 BCR FcR CR 丝裂原受体丝裂原受体 EBV R2.表面抗原表面抗原 MHC抗原抗原 CD抗原(抗原(CD19、20、21、23、45)40正常和肿瘤组织细胞的培养密度梯度离心法密度梯度离心法外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作)作密度梯度离心密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。41正常和肿瘤组织细胞的培养外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴
25、细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll:1.0770.001(PBMC)1.092PBMC:Peripheral blood mononuclear cell42正常和肿瘤组织细胞的培养1.1.每毫升外周血液大约可获每毫升外周血液大约可获1 110106 6单个核细胞单个核细胞 2.Ficoll2.Ficoll应适量,外周血应充分稀释应适量,外周血应充分稀释 2.2.温度直接影响到温度直接影响到FicollFicoll的比重和分离效果的比重和分离效果 3.3.在在FicollFicoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面上加入稀释外周血时,应
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