实验肿瘤学基本概念培训课件.ppt

1、实验肿瘤学基本概念实验肿瘤学基本概念肿瘤发生发展的一般过程正常细胞 癌细胞 原位癌 浸润癌 转移癌 休 眠 预防 诊断 治疗实验肿瘤学基本概念2肿瘤细胞的生物学特点肿瘤细胞的生物学特点 自我满足的生长信号自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡逃避凋亡 无限增殖的潜能无限增殖的潜能 血管生成血管生成 浸润和转移浸润和转移实验肿瘤学基本概念3实验肿瘤模型的要求实验肿瘤模型的要求忠实地重现人类肿瘤的生物学特性忠实地重现人类肿瘤的生物学特性实验肿瘤学基本概念4实验肿瘤学的研究方法实验肿瘤学的研究方法5 直接研究直接研究 建立细胞系建立细胞系 建立动物模型建立动物模型实验

2、肿瘤学基本概念6细胞系的基本概念细胞系的基本概念组织培养和细胞培养：模拟体内环境在体外培养机体组织培养和细胞培养：模拟体内环境在体外培养机体组织和细胞，使之生存和生长。组织和细胞，使之生存和生长。原代培养原代培养（primary culture）:从体内取出组织和细胞的从体内取出组织和细胞的第一次培养。第一次培养。传代传代（passage）：细胞长满培养瓶后，细胞分成）：细胞长满培养瓶后，细胞分成2-3瓶继瓶继续培养。续培养。细胞系细胞系（cell line）:原代培养细胞首次传代成功后的细胞，原代培养细胞首次传代成功后的细胞，称细胞系。称细胞系。Finite cell line,contin

3、uous cell line,established cell line细胞株细胞株(cell strain):通过选择或克隆，从亲代细胞系选出通过选择或克隆，从亲代细胞系选出的带有特定标志的细胞群。的带有特定标志的细胞群。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物收集中心,美国菌种保存中心实验肿瘤学基本概念7培养细胞的生长方式贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。上皮细胞型：来源于外胚层和内胚层的细胞，细胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。成纤维细胞型：来源于中胚层的

4、细胞，细胞呈梭形，排列成漩状、放射状、栅栏状。悬浮生长型：造血系统的细胞实验肿瘤学基本概念8培养细胞的生长特点贴附生长：支持物可为玻璃、塑料、胶原、其他细胞等。停泊或贴壁依赖性细胞（anchorage-dependent cell)接触抑制(contact inhibition)：正常细胞相互接触后，细胞将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。密度抑制(density inhibition)：正常细胞汇合成片后细胞分裂停止，在静止状态下细胞存活一段时间 汇合 confluent实验肿瘤学基本概念9培养条件培养条件基本营养成分基本营养成分 RPMI1640 DMEM(Dulbeccos mo

5、dified Eagle medium)谷谷氨酰胺氨酰胺生长因子生长因子 小牛血清小牛血清 胎牛血清胎牛血清 灭活补体灭活补体 56 30min 环境环境 37 pH 7.2-7.4 渗透压渗透压 无污染无毒无污染无毒 细菌、细菌、支原体支原体 实验肿瘤学基本概念10体外培养的优点体外培养的优点优点：优点：1.活细胞，活细胞，2.对象均匀，易控制实验条件，易于观察和纪对象均匀，易控制实验条件，易于观察和纪录实验结果录实验结果 3.易研究单个细胞的结构和功能，易于进行分易研究单个细胞的结构和功能，易于进行分子生物学水平研究，子生物学水平研究，4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，

6、成本低，细胞系可长期保存。实验肿瘤学基本概念11体外培养的缺点体外培养的缺点 1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，G1 G0 终末分化终末分化肿瘤细胞肿瘤细胞 M S介质细胞介质细胞 G2实验肿瘤学基本概念122.转化（转化（transformation）:在体外培养过在体外培养过程中细胞的遗传性状发生变化。分为一般程中细胞的遗传性状发生变化。分为一般转化和恶性转化。转化和恶性转化。一般转化一般转化：指细胞获得不死性。：指细胞获得不死性。恶性转化恶性转化：指出现在软琼脂培养基中浸：指出现在软琼脂培养基中浸 润生长；在动物体内成瘤；血清依赖性降润生

7、长；在动物体内成瘤；血清依赖性降低；生长密度依赖性降低。低；生长密度依赖性降低。3.体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验实验肿瘤学基本概念13细胞培养的应用细胞培养的应用 研究细胞与环境的相互作用研究细胞与环境的相互作用 细胞间的相互作用细胞间的相互作用 细胞内胞质活动细胞内胞质活动 细胞质与细胞核之间的流动细胞质与细胞核之间的流动实验肿瘤学基本概念14建立细胞系的基本要求建立细胞系的基本要求 细胞在体外培养半年以上，生长稳定，细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。保持细胞特征并能传代。实验肿瘤学基本概念15建系方法建系方法1.原代培养原代培养：无菌操

8、作，：无菌操作，取肿瘤组织，切成小片，小于取肿瘤组织，切成小片，小于0.5毫米，进行培养，毫米，进行培养，或用胰酶、胶原酶消化成单细胞悬液，或用胰酶、胶原酶消化成单细胞悬液，血清灭活酶，培养血清灭活酶，培养2.传代传代：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1：2-3传代传代3.去除杂细胞去除杂细胞4.冻存细胞冻存细胞 10%DMFO+90%胎牛血清，胎牛血清，4 30min,-20 2hrs,2hrs,-70 -70 过夜过夜,液氮，长期液氮，长期保存。保存。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。复苏：复苏：37 37 水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次

9、，培养 5.鉴定鉴定实验肿瘤学基本概念16鉴 定细胞形态观察细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞染色体分析染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期集落形成率集落形成率动物接种动物接种 成瘤，成瘤，组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似污染污染 无病毒、无病毒、支原体污染支原体污染、细胞间交叉污染细胞间交叉污染 Hela cell:1951年年 Henrietta Lack 宫颈癌宫颈癌 实验肿瘤学基本概念17实验动物基础知识实验动物基础知识

10、18法法 规规 1988年年 中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例 1989年年 医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则 1994年年 关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格证制度得通知证制度得通知 （医学实验动物合格证书，医学实验（医学实验动物合格证书，医学实验动物环境设施合格证书，医学实验动物全价营养饲料动物环境设施合格证书，医学实验动物全价营养饲料合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书）1988年年 广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法实验肿瘤学基本概念19基本概

11、念基本概念 实验动物实验动物（laboratory animal）:指人工培育的、指人工培育的、对其携带微生物实行控制、来源清楚、遗传背对其携带微生物实行控制、来源清楚、遗传背景清晰、可用于科学实验得动物。景清晰、可用于科学实验得动物。实验用动物实验用动物（animal for research）:能用于科能用于科学实验的动物，包括实验动物、野生动物、经学实验的动物，包括实验动物、野生动物、经济动物和观赏动物。济动物和观赏动物。标准化实验动物标准化实验动物：有明确的遗传背景、繁殖方：有明确的遗传背景、繁殖方法、饲养环境、饲料成分均达到标准的实验动法、饲养环境、饲料成分均达到标准的实验动物。在科

12、学研究中必须使用标准化实验动物。物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。实验肿瘤学基本概念20实验动物的分类实验动物的分类(遗传背景遗传背景)近交系（纯系）近交系（纯系）：连续：连续20代以上兄妹交配或亲子交配代以上兄妹交配或亲子交配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/c小鼠。小鼠。杂交群杂交群:两个近交系动物间有计划进行交配获得的第两个近交系动物间有计划进行交配获得的第一代动物。一代动物。封闭群封闭群：由同一血缘品系进行自由交配，在固定场所：由同一血缘品系进行自由交配，在固定场所保存繁殖保存繁殖5年以上得动物群，如年以上得动物群，如Wistar 大

13、鼠、大鼠、SD大鼠。大鼠。突变系突变系：正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物，：正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物，如裸鼠如裸鼠实验肿瘤学基本概念21按微生物控制分类按微生物控制分类一级一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。二级二级：清洁动物，不携带人畜共患疾病病原体和动物传染：清洁动物，不携带人畜共患疾病病原体和动物传染病病原体的动物。病病原体的动物。三级三级：无特定病原体的动物（：无特定病原体的动物（specific pathogen free,SPF）,动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的实验

14、动物。实验动物。四级四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。一级动物只能用于教学和某些研究的预实验，卫生部以一级动物只能用于教学和某些研究的预实验，卫生部以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物实验肿瘤学基本概念22免疫缺陷动物免疫缺陷动物实验肿瘤学基本概念23裸小鼠（裸小鼠（nude mice）1962年英国发现。鼠年英国发现。鼠11号染色体裸基因号染色体裸基因nu是隐性突变基因。是隐性突变基因。裸基因纯合子（裸基因纯合子（nu/nu）鼠的特征）鼠的特征:1.全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。2.

15、胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上皮细胞不能增殖，T细胞发育受阻，细胞发育受阻，T细胞免疫缺细胞免疫缺陷陷。3.B 细胞形态正常，功能较差，免疫球蛋白以细胞形态正常，功能较差，免疫球蛋白以 Ig M 为主，少为主，少量量Ig G，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，T细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用4-8周鼠。周鼠。4.裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，应饲养在裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，应饲养在SPF 环境。环境。5.纯合型雌鼠不能生育，纯合型雌鼠不能生育，/nu/+/nu/+和和/nu/nu/nu/nu交配可获交配可获

16、1/2 1/2 纯合子鼠。纯合子鼠。常用常用BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu。实验肿瘤学基本概念24应 用 建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌机理：1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。实验肿瘤学基本概念25裸大鼠(nude rat)1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵抗力低下。实验肿瘤学基本概念26严重联合免疫缺陷鼠(seve

17、re combined immune deficiency mice,SCID)1982年美国发现于C.B-17/ICR品系。Scid位于16号染色体，是隐性突变基因。纯合子scid/scid T细胞和B细胞功能缺陷，血清中无免疫球蛋白，外周血淋巴细胞数量明显减少。NK 细胞功能正常。接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤，可获得高纯度的单克隆抗体。SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。实验肿瘤学基本概念27动物肿瘤模型28 自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。实验肿瘤学基本概念29 诱发肿瘤：用化学、物理、生物等因素在动物体内诱发

18、的肿瘤。物理、生物因素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定，常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病因、化学预防的研究实验肿瘤学基本概念30诱发肿瘤模型的基本要求 简单易行、易重复 选择对特定致癌物敏感的动物种系：多环方香烃-皮肤/小鼠；甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠；甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠 恰当的致癌物剂量：动物存活率高，诱发周期短。诱发的肿瘤类似于人类肿瘤实验肿瘤学基本概念31 原位诱发：如：0.25二已基亚硝胺 0.251 ml 灌胃6月，70发生肝癌 异位诱发：将与致癌物作用过的器官或组织移植于自体或同系、同基因正常动物皮下，诱发所需的肿瘤。如：甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子宫颈，将子宫颈切除，移植

19、于同系成年小鼠皮下，3个月后诱发异位子宫颈癌实验肿瘤学基本概念32 可移植性肿瘤 肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。实验肿瘤学基本概念33移植部位 原位移植（orthotopic implantation）异位移植(ectopic implantation)皮下、肾包膜下、腹腔实验肿瘤学基本概念35可移植性肿瘤的参考标准 传15-20代以上 接种成活率100%，自发消消退率2年)的状态,此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡。微小转移灶（micro-metastasis）:在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿

20、瘤细胞实验肿瘤学基本概念41转基因动物肿瘤模型理论基础：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果 2 基因功能在进化中是保守的 实验肿瘤学基本概念42转基因动物外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。用途：生物医药 基因表达调控 单基因表达调控 多基因表达调控 基因敲除（knock out)实验肿瘤学基本概念43转基因方法 DNA 逆转录病毒/DNA转染 胚胎干细胞 显微注射受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 显微注射 逆转录病毒DNA DNA实验肿瘤学基本概念44纤维注射与逆转录病毒转染的比较转基因方式 显微注射 逆转录病毒转染DNA导入 50kb,单细胞受精卵 10-15

21、kb,46细胞卵培养液 M16 高营养液移卵 输卵管 子宫整合 随机整合，多拷贝 随机整合，嵌合体，单拷贝表达 受旁侧序列影响 受病毒LTR影响，在一定范围内表达水平 易缺失 与拷贝数成正比传代 可传代 整合至生殖细胞的可传代实验肿瘤学基本概念45显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序 供体母鼠 注射激素、交配 鼠受精卵目的基因 显微注射 注射DNA的受精卵 假孕母鼠 娩出幼鼠 鉴定实验肿瘤学基本概念46C57BL/6肝癌模型p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53+/-HBV+P53+/-HBV-p53+/+HBV+P53+/+HBV-AFB1 10mg/kg i.p实验肿瘤学基本概念47Group HBV p53 AFB1 SEX N HCC Ia +/-+M 7 7/7 +/-+F 8 5/8 IIa +/+M 16 11/16 +/+F 6 0/6 IIIa -+/-+M 7 2/7 -+/-+F 9 1/9 IVa -+/+M 10 1/10 -+/+F 7 0/7 Ib +/-M 8 1/8 IIb +/+-F 5 0/5实验肿瘤学基本概念48