基层培训之免疫学技术培训课件.ppt
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1、基层培训之免疫学技基层培训之免疫学技术术临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原理和技术,检查临床标本中的微生物抗原、理和技术,检查临床标本中的微生物抗原、肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗体,为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病体,为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供诊断依据。以及免疫缺陷提供诊断依据。2基层培训之免疫学技术免疫检验分为两个部分,一部分为利用免疫检免疫检验分为两个部分,一部分为利用免疫检测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相
2、关物质,另细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质,另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了有效的实验依据。有效的实验依据。3基层培训之免疫学技术第一节第一节 免疫学检验原理、特点和方法免疫学检验原理、特点和方法 4基层培训之免疫学技术一、免疫学检验原理一、免疫学检验原理(一)抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特
3、异性结(一)抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。它既可发生在体内,也可发生在体外。在体内合反应。它既可发生在体内,也可发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应,根据参与反应的抗原的物理性外的抗原抗体结合反应,根据参与反应的抗原的物理性状(可溶性或颗粒性)以及参与反应的条件(电解质、状(可溶性或颗粒性)以及参与反应的条件(电解质、补体等)不同,表现出不同的现象,如沉淀、凝集、细补体等)不同,表现出不同的现象,如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合和毒素中和等。胞溶解、补体结合和毒素中和等。一般将
4、检查血清中病一般将检查血清中病原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。5基层培训之免疫学技术抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异性结合阶段,此阶段仅需数秒至数分钟,但并不性结合阶段,此阶段仅需数秒至数分钟,但并不出现可见的反应;第二阶段为可见反应阶段,这出现可见的反应;第二阶段为可见反应阶段,这一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、pH、温度和补体等的影响下,进一步交联聚集,出现温度和补体等的影响下,进一步交联聚集,出现凝集、沉淀、溶解和补体结合介导的生物现象等凝集、沉淀、
5、溶解和补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢,往往需要肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢,往往需要数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分,所数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分,所需的时间也受多种因素的影响。需的时间也受多种因素的影响。6基层培训之免疫学技术(二)抗原抗体反应的特点:(二)抗原抗体反应的特点:1、特异性、特异性抗原抗体反应的特异性(抗原抗体反应的特异性(specificity)是指抗原分子上)是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性,由这两的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性,由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一个分子之间空
6、间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一样,所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉样,所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉抗抗毒素只能与相应的外毒素结合,而不能与破伤风外抗抗毒素只能与相应的外毒素结合,而不能与破伤风外毒素结合。毒素结合。因此,在抗原抗体反应的免疫学实验中,可因此,在抗原抗体反应的免疫学实验中,可以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗原。原。7基层培训之免疫学技术2、比例性、比例性比例性(比例性(proportionality)是指抗原与抗体特异)是指抗原与抗体特异性结合反应时,生成肉眼可见结合物的量与反性结合
7、反应时,生成肉眼可见结合物的量与反应物浓度的关系,只有当二者浓度比例适当时,应物浓度的关系,只有当二者浓度比例适当时,才出现可见反应。才出现可见反应。抗原抗体分子比例合适的范抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带。围,称为抗原抗体反应的等价带。在此范围抗在此范围抗原抗体结合充分,沉淀物形成得快而多。原抗体结合充分,沉淀物形成得快而多。8基层培训之免疫学技术在等价带的前后,由于抗体和抗原的过量,上在等价带的前后,由于抗体和抗原的过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少。物少。当抗体过量时,称为前带,抗原过量时当抗体过量时,称为前带
8、,抗原过量时称为后带。称为后带。因此,在抗原抗体反应的试验中,因此,在抗原抗体反应的试验中,如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现,如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现,一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在,一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在,另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适当。当。9基层培训之免疫学技术3、可逆性、可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后,在一定条件下抗原与相应抗体结合成复合物后,在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性(结合的可逆性(reversibil
9、ity)。由于抗原抗体的)。由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合,故形成的复合结合是分子表面的非共价键结合,故形成的复合物是不牢固的,在一定的条件下可以解离,所以物是不牢固的,在一定的条件下可以解离,所以说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。动态平衡过程。10基层培训之免疫学技术抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素:一是抗体抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素:一是抗体对相应抗原的对相应抗原的亲和力亲和力;二是;二是环境因素环境因素对复合物的影响。对复合物的影响。亲和力高的抗体与抗原表位在空间构型上非常适合,亲和力高的抗体与抗原
10、表位在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不容易解离,反之,亲和力低的抗体两者结合牢固,不容易解离,反之,亲和力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或过低均可破坏离子间的静电引力,使抗原抗体的结合过低均可破坏离子间的静电引力,使抗原抗体的结合力下降。增加离子强度,也可使静电引力消失,降低力下降。增加离子强度,也可使静电引力消失,降低抗原抗体的结合力,促使其解离。解离后的抗原和抗抗原抗体的结合力,促使其解离。解离后的抗原和抗体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。11基层培训之免疫学技术(三)影响抗原抗体
11、反应的因素(三)影响抗原抗体反应的因素 影响抗原抗体反应的因素较多,主要影响抗原抗体反应的因素较多,主要有两方面:一是反应物自身的因素,另一有两方面:一是反应物自身的因素,另一方面是反应环境的因素。方面是反应环境的因素。12基层培训之免疫学技术1、反应物自身因素、反应物自身因素(1)抗原)抗原抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象;可溶性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象;可溶性抗原与相应抗体结合后产生沉淀现象;单价抗原原与相应抗体结合后产生沉淀
12、现象;单价抗原与相应抗体结合后不出现沉淀现象。与相应抗体结合后不出现沉淀现象。13基层培训之免疫学技术(2)抗体)抗体来源来源 来源于不同动物的免疫血清,其反应性来源于不同动物的免疫血清,其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清,由于有差异。家兔等大多数动物的免疫血清,由于具有较宽的等价带,与相应抗原结合易出现可具有较宽的等价带,与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄,抗原不足或过剩,均易形成可溶性复合带窄,抗原不足或过剩,均易形成可溶性复合物。物。单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反应。
13、应。14基层培训之免疫学技术浓度浓度 抗体的浓度往往是与抗原相对而言,二抗体的浓度往往是与抗原相对而言,二者合适的浓度才易出现可见的反应结果。者合适的浓度才易出现可见的反应结果。特异性和亲和力特异性和亲和力 特异性与亲和力是影响抗原特异性与亲和力是影响抗原抗体反应的关键因素,它们共同影响试验结果抗体反应的关键因素,它们共同影响试验结果的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的抗体,才能提高试验的可靠性。高亲和力的抗体,才能提高试验的可靠性。15基层培训之免疫学技术2、反应的环境条件、反应的环境条件(1)电解质)电解质抗原抗体结合后,由亲水性向疏水
14、性转换过程中必须抗原抗体结合后,由亲水性向疏水性转换过程中必须要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷,破坏水化层,使复合物相互靠拢聚集,形成去电荷,破坏水化层,使复合物相互靠拢聚集,形成大块凝集、沉淀。若无电解质存在,则不出现可见反大块凝集、沉淀。若无电解质存在,则不出现可见反应。应。在抗原抗体反应中,通常使用在抗原抗体反应中,通常使用0.85%NaCl溶液或溶液或各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。16基层培训之免疫学技术(2)酸碱度)酸碱度抗原抗体反应必须在合适的抗原抗体反应必须在合适的pH
15、环境中进行,环境中进行,pH过低或过高都会影响抗原抗体的反应。过低或过高都会影响抗原抗体的反应。抗原抗抗原抗体反应中一般以体反应中一般以pH69为宜。为宜。有补体参与的反有补体参与的反应应pH为为7.27.4,超过这个范围会降低补体的酶,超过这个范围会降低补体的酶活性而影响反应。活性而影响反应。17基层培训之免疫学技术(3)温度)温度抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一般以般以1540为宜,为宜,最适温度为最适温度为37。在此范围内,。在此范围内,温度越高,抗原抗体分子运动越快,碰撞接触机会越温度越高,抗原抗体分子运动越快,碰撞接触机会越
16、多,两者结合反应速度越快。但是如果温度高于多,两者结合反应速度越快。但是如果温度高于56,会导致抗原抗体复合物解离,甚至分子变性。温度越会导致抗原抗体复合物解离,甚至分子变性。温度越低,反应速度越缓慢,但抗原抗体结合越牢固,易于低,反应速度越缓慢,但抗原抗体结合越牢固,易于观察。观察。18基层培训之免疫学技术(4)振荡)振荡在抗原抗体反应中,适当的在抗原抗体反应中,适当的振摇可振摇可促使促使抗原抗体分子的接触,抗原抗体分子的接触,加速其反应加速其反应。19基层培训之免疫学技术(四)抗原抗体反应的类型(四)抗原抗体反应的类型随着免疫学技术的飞速发展,在原有经典免疫随着免疫学技术的飞速发展,在原有
17、经典免疫学实验方法基础上,新的免疫学测定方法不断学实验方法基础上,新的免疫学测定方法不断出现,使免疫学实验技术更特异、更敏感和更出现,使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同,反应稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同,反应出现的现象和结果的不同,以及反应时参与的出现的现象和结果的不同,以及反应时参与的其他条件不同,将抗原抗体反应分为五种类型。其他条件不同,将抗原抗体反应分为五种类型。20基层培训之免疫学技术(1)可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀)可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀反应;(反应;(2)颗粒抗原与相应抗体结合发生的)颗粒抗原与相应抗体结合发生的凝集反应;
18、(凝集反应;(3)抗原抗体结合后激活补体所)抗原抗体结合后激活补体所产生的溶细胞反应;(产生的溶细胞反应;(4)细菌外毒素或病毒)细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应;(与相应抗体结合所致的中和反应;(5)标记)标记免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若干实验技术。(见抗原抗体反列应表干实验技术。(见抗原抗体反列应表1)21基层培训之免疫学技术表表1 抗原抗体反应的类型和试验方法抗原抗体反应的类型和试验方法-反应类型反应类型 实验方法实验方法 结果判断结果判断-沉淀反应沉淀反应液相沉淀实验液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度观察沉淀、检测浊度 琼脂凝
19、胶扩散琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环观察和测定扫描沉淀线或环 凝胶电泳技术凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等观察和测定扫描沉淀峰弧等凝集反应凝集反应直接凝集实验直接凝集实验用裸眼、放大镜或显微镜观察红用裸眼、放大镜或显微镜观察红 细胞或胶乳颗粒的凝集现象细胞或胶乳颗粒的凝集现象 间接凝集实验间接凝集实验 同上同上 凝集抑制实验凝集抑制实验 同上同上 协同凝集实验协同凝集实验 同上同上 抗球蛋白实验抗球蛋白实验 同上同上-22基层培训之免疫学技术-补体参与反应补体参与反应补体溶血实验补体溶血实验 以裸眼或光电比色仪观察以裸眼或光电比色仪观察 测定溶血现象测定溶血现象 补体结合实验补体结合
20、实验 同上同上中和反应中和反应 病毒中和实验病毒中和实验病毒感染性丧失病毒感染性丧失 毒素中和实验毒素中和实验外毒素毒性丢失外毒素毒性丢失标记免疫标记免疫 荧光免疫技术荧光免疫技术 检测荧光检测荧光 放射免疫技术放射免疫技术 检测放射性检测放射性 酶标免疫酶标免疫 检测酶底物显色、发光、荧光检测酶底物显色、发光、荧光 发光免疫技术发光免疫技术 检测发光检测发光 金标免疫技术金标免疫技术 观察金颗沉淀线观察金颗沉淀线-23基层培训之免疫学技术二、免疫学检验方法和应用二、免疫学检验方法和应用(一)凝集反应(一)凝集反应颗粒性抗原或可溶性抗原(或抗体)与载体颗粒结合成致敏颗粒颗粒性抗原或可溶性抗原(
21、或抗体)与载体颗粒结合成致敏颗粒后,与相应抗体(或抗原)发生特异性反应,在适当电解质存在后,与相应抗体(或抗原)发生特异性反应,在适当电解质存在下,形成肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应。凝集试验应用广下,形成肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应。凝集试验应用广而且敏感度高,方法简便,迄今已成为通用的免疫学技术之一,而且敏感度高,方法简便,迄今已成为通用的免疫学技术之一,广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等临床检验。在免疫检验技术中,根据参与反应的颗粒的不同,把临床检验。在免疫检验技术中,根据参与反应的颗粒的不同,把凝集反应
22、分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。24基层培训之免疫学技术1、直接凝集反应:、直接凝集反应:细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原,在适当细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体反应,当二者电解质参与下可直接与相应抗体反应,当二者比例适当时,出现凝集,称为直接凝集反应。比例适当时,出现凝集,称为直接凝集反应。反应中的抗原称为凝集原,参与反应的抗体称反应中的抗原称为凝集原,参与反应的抗体称为凝集素。
23、常用的凝集试验有玻片法、试管法为凝集素。常用的凝集试验有玻片法、试管法和微量血凝反应板法。和微量血凝反应板法。25基层培训之免疫学技术(1)玻片凝集试验:多用于定性。用以知抗体诊断血)玻片凝集试验:多用于定性。用以知抗体诊断血清与受检菌液在玻片上混匀,放置数分钟后如抗体与清与受检菌液在玻片上混匀,放置数分钟后如抗体与相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。玻片凝集试验。(2)试管凝集试验:多用于半定量和定量试验,常用)试管凝集试验:多用于半定量和定量试验,常用已知一定量的抗原(细菌、细胞等)与一系列稀释的已知一定量的抗原(细菌、
24、细胞等)与一系列稀释的病人血清混合,在保温放置后观察结果,判定受检血病人血清混合,在保温放置后观察结果,判定受检血清有无相应抗体以及效价,如肥达反应。清有无相应抗体以及效价,如肥达反应。26基层培训之免疫学技术2、间接凝集反应:将可溶性抗原(或抗体)先吸附、间接凝集反应:将可溶性抗原(或抗体)先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面,使之成为致或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面,使之成为致敏载体颗粒,然后与相应抗体(或抗原)作用,在适敏载体颗粒,然后与相应抗体(或抗原)作用,在适宜的电解质存在条件下,出现特异性的凝集现象,称宜的电解质存在条件下,出现特异性的凝集现象,称为间接凝集反应。其敏感度
25、比直接凝集反应高为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高28倍,倍,亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为:可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为:27基层培训之免疫学技术(1)间接凝集试验:用抗原致敏载体以检测)间接凝集试验:用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结合,再与样品中的抗体反应,形成肉眼可见结合,再与样品中的抗体反应,形成肉眼可见的凝集颗粒或凝集块者为阳性。的凝集颗粒或凝集块者为阳性。28基层培训之免疫学技术(2)反向间接凝
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