免疫实验课安排培训课件.ppt

1、免疫实验课安排 实验报告书写的原则实验报告书写的原则 实验题目：实验题目：单核细胞分离单核细胞分离 实验时间：实验时间：2012.3.28 实验目的：实验目的：分离人类外周血单核细胞分离人类外周血单核细胞 实验原理：实验原理：由于不同细胞的密度不同，因此可利用密度梯度由于不同细胞的密度不同，因此可利用密度梯度 离心法将不同比重的细胞分开。离心法将不同比重的细胞分开。实验材料：实验材料：试管、抗凝血试管、抗凝血 实验步骤与结果：实验步骤与结果：肉眼可见灰白层，肉眼可见灰白层，1ml血收获血收获xx细胞。细胞。结果分析：结果分析：本次分离细胞较正常人单个核细胞数少，可能原本次分离细胞较正常人单个核

2、细胞数少，可能原 因一是实验误差所致，二是该患者为白细胞减少因一是实验误差所致，二是该患者为白细胞减少 症。症。2免疫实验课安排实验设计的原则实验设计的原则 研究的题目：研究的题目：确定研究题目是开展研究工作的首确定研究题目是开展研究工作的首要任务。要任务。研究摘要：研究摘要：研究背景，要开展的主要研究（可以研究背景，要开展的主要研究（可以叙述利用什么样的方法开展研究），研究意义叙述利用什么样的方法开展研究），研究意义（本次研究的预期成果及其推动科学进步的作（本次研究的预期成果及其推动科学进步的作用）。用）。研究内容：研究内容：叙述主要开展的工作。叙述主要开展的工作。研究方案：研究方案：利用什

3、么样的手段去解决研究内容提利用什么样的手段去解决研究内容提到的相关工作。到的相关工作。研究的特色与创新之处：研究的特色与创新之处：主要科学贡献。主要科学贡献。3免疫实验课安排 题目：题目：XX细胞因子细胞因子诱导肺癌细胞凋亡的作用及其机制研究诱导肺癌细胞凋亡的作用及其机制研究 摘要：摘要：肺癌是最常见的肿瘤之一。肺癌是最常见的肿瘤之一。XX与多种肿瘤的发生发展与多种肿瘤的发生发展有关，但其在肺癌中的作用仍缺乏报道。本研究采用人肺癌有关，但其在肺癌中的作用仍缺乏报道。本研究采用人肺癌细胞，利用流式细胞术分析细胞，利用流式细胞术分析XX诱导人肺癌细胞凋亡作用，通诱导人肺癌细胞凋亡作用，通过分析过分

4、析Caspase3,8,12等确定等确定XX诱导肿瘤细胞凋亡机制。本诱导肿瘤细胞凋亡机制。本研究不仅可以进一步揭示研究不仅可以进一步揭示XX抗肿瘤作用机制，也为寻找新的抗肿瘤作用机制，也为寻找新的肺癌治疗方法提供研究基础。肺癌治疗方法提供研究基础。研究内容：研究内容：1）XX在人肺癌肿瘤细胞的表达分析，确定在人肺癌肿瘤细胞的表达分析，确定XX表表达与达与肺肿瘤的关系。肺肿瘤的关系。2）检测患者血清）检测患者血清XX水平，确定其辅助水平，确定其辅助诊断肺癌的价值诊断肺癌的价值 研究方案：研究方案：1）采用肿瘤组织切片，通过免疫细胞化学染色观）采用肿瘤组织切片，通过免疫细胞化学染色观察察XX在人肺

5、癌组织中的表达情况。在人肺癌组织中的表达情况。2）采用）采用ELISA法检测血法检测血清清XX水平。水平。研究的特色与创新之处：研究的特色与创新之处：本研究阐述了本研究阐述了XX与肺癌的关系，并与肺癌的关系，并提出提出XX可作为肺癌的血清学诊断标志物，研究发现可作为肺癌的血清学诊断标志物，研究发现XX可以诱可以诱导肺癌细胞凋亡，并阐述了其作用机制。导肺癌细胞凋亡，并阐述了其作用机制。4免疫实验课安排实验设计考试实验设计考试 肿瘤患者存在多种免疫异常，请设计一个肿瘤患者存在多种免疫异常，请设计一个实验分析肿瘤患者体内巨噬细胞功能。实验分析肿瘤患者体内巨噬细胞功能。主要包括主要包括 1）题目）题目

6、 2）研究内容）研究内容 3）研究方案）研究方案 4）预期结果）预期结果5免疫实验课安排主讲：倪维华主讲：倪维华Email:6免疫实验课安排7免疫实验课安排凝集反应凝集反应琼脂沉淀反应琼脂沉淀反应中和反应中和反应补体结合反应补体结合反应环状法环状法絮状法絮状法沉淀反应沉淀反应单向免疫扩散、单向免疫扩散、双向免疫扩散双向免疫扩散对流免疫电泳、火箭电泳对流免疫电泳、火箭电泳免疫电泳免疫电泳反应分类反应分类8免疫实验课安排实验原理实验原理:在试管中，在试管中，颗粒性抗原颗粒性抗原与与相应相应抗体抗体在有适量电在有适量电解质存在时，直接结合可形成肉眼可见的解质存在时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块凝集

7、块。9免疫实验课安排 利用凝集试验判断抗体的效价利用凝集试验判断抗体的效价 效价：效价：也称滴度，它的表示法与抗体的稀也称滴度，它的表示法与抗体的稀释倍数有关，一般以该抗体能与其对应的释倍数有关，一般以该抗体能与其对应的抗原发生可见反应的抗原发生可见反应的最高稀释度最高稀释度来表示。来表示。10免疫实验课安排名称名称量量/组组生理盐水生理盐水20ml20ml0.5%0.5%压积血（压积血（RBCRBC）8ml8ml抗体抗体1ml1ml1ml1ml刻度吸管刻度吸管2 2支支1ml 1ml 加样器加样器1 1支支1ml 1ml 加样器头加样器头若干若干小试管小试管2828支支(7(7支支/人人)试

8、管架试管架1 1个个3737孵箱孵箱1 1个个/室室记号笔记号笔1 1只只实验以个人为单位，物品四个人一组实验以个人为单位，物品四个人一组11免疫实验课安排12免疫实验课安排1.1.取七只抗体稀释管，编号。取七只抗体稀释管，编号。2.2.每只管中先加入生理盐水每只管中先加入生理盐水0.5ml0.5ml。3.3.取取0.5ml0.5ml血清加入第一管中，混匀后取出血清加入第一管中，混匀后取出0.5ml0.5ml加入第二管，依此类推。加入第二管，依此类推。4.4.第第7 7管为阴性对照，不加抗体（血清）。管为阴性对照，不加抗体（血清）。0.5ml 生理盐水生理盐水1/60 1/120 1/240

9、1/480 1/960 1/1920 -1/30血清血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51 2 3 4 5 6 7 13免疫实验课安排14免疫实验课安排15免疫实验课安排16免疫实验课安排双向免疫扩散实验双向免疫扩散实验17免疫实验课安排18免疫实验课安排 抗体效价的判定抗体效价的判定 检测体液中各种蛋白成分检测体液中各种蛋白成分19免疫实验课安排20免疫实验课安排玻片正面标记组别用5ml吸管吸取预热的1.5%琼脂4ml冷却后按纸样打孔，每块载玻片打两组孔，加样湿盒中反应（over night)37NOTE:NOTE:加样时应将加样器头插入孔底，缓慢加入液体，直到孔满（约加样时

10、应将加样器头插入孔底，缓慢加入液体，直到孔满（约8-10ul8-10ul）1抗OVA抗体OVABSABSAOVA抗OVA抗体21免疫实验课安排22免疫实验课安排23免疫实验课安排24免疫实验课安排抗原抗体反应的特点1.抗原与抗体的结合是抗原与抗体的结合是特异性特异性的的 交叉反应交叉反应2.抗原抗体结合是抗原抗体结合是可逆可逆的的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个抗原抗体反应可分为两个阶段阶段 抗原抗体特异性结合阶段抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段可见反应阶段4.抗原抗体

11、的抗原抗体的分子比例分子比例与抗原抗体结合是否呈现与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关可见的反应现象密切相关 1.抗原与抗体的结合是抗原与抗体的结合是特异性特异性的的 交叉反应交叉反应2.抗原抗体结合是抗原抗体结合是可逆可逆的的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个抗原抗体反应可分为两个阶段阶段 抗原抗体特异性结合阶段抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段可见反应阶段4.抗原抗体的抗原抗体的分子比例分子比例与抗原抗体结合是否呈现与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关可

12、见的反应现象密切相关 1.抗原与抗体的结合是抗原与抗体的结合是特异性特异性的的 交叉反应交叉反应2.抗原抗体结合是抗原抗体结合是可逆可逆的的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个抗原抗体反应可分为两个阶段阶段 抗原抗体特异性结合阶段抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段可见反应阶段4.抗原抗体的抗原抗体的分子比例分子比例与抗原抗体结合是否呈现与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关可见的反应现象密切相关 25免疫实验课安排抗体过剩区抗原过剩区等价区26免疫实验课安排抗原-抗体反

13、应受多种因素影响 电解质电解质：抗原：抗原-抗体反应通常应用抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度，以供给适应浓度的电解质。的电解质。温度温度：一般常使反应在：一般常使反应在37度水浴或孵育度水浴或孵育箱中进行。箱中进行。酸碱度酸碱度：抗原：抗原-抗体反应适应的酸碱度为抗体反应适应的酸碱度为PH68。27免疫实验课安排凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等细菌、红细胞等颗粒性抗原颗粒性抗原或吸附于或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应应抗体抗体（或抗原），在电解质存在的条件（或抗原），在电解质存在

14、的条件下形成凝集物的现象，称为凝集反应。下形成凝集物的现象，称为凝集反应。28免疫实验课安排凝集反应的分类直接凝集反应直接凝集反应 间接凝集反应间接凝集反应间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验协同凝集试验协同凝集试验抗球蛋白试验抗球蛋白试验29免疫实验课安排直接凝集试验（Direct Agglutination）细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。1.玻片法：玻片法：定性试验定性试验 菌种鉴定及血型鉴定菌种鉴定及血型鉴定 2.试管法：试管法：半定量试验半定量试验 抗体效价滴定抗体效价

15、滴定30免疫实验课安排间接（被动）凝集反应（Indirect/Passive Agglutination）将可溶性抗原（或抗体）吸附于一将可溶性抗原（或抗体）吸附于一种与免疫无关的、一定大小的载体表面，种与免疫无关的、一定大小的载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在电然后与相应抗体（或抗原）作用，在电解质存在的条件下出现凝集现象。解质存在的条件下出现凝集现象。31免疫实验课安排间接凝集抑制试验（Indirect Agglutination Inhibition）可溶性抗原与相应抗体充分作用可溶性抗原与相应抗体充分作用后，再加入抗原致敏的载体颗粒，此时后，再加入抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体

16、已被可溶性抗原结合，不会再出因抗体已被可溶性抗原结合，不会再出现载体凝集现象。现载体凝集现象。32免疫实验课安排协同凝集试验（Coagglutination）金黄色葡萄球菌细胞壁中的金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白蛋白（SPA）能与人及哺乳动物血清中）能与人及哺乳动物血清中IgG类抗类抗体的体的Fc段结合。段结合。IgG的的Fc段与段与SPA结合后，结合后，其其Fab段与特异性抗原结合出现特异的凝段与特异性抗原结合出现特异的凝集现象。集现象。检测血液、脑脊液及其他分泌液中的检测血液、脑脊液及其他分泌液中的微量抗原。微量抗原。33免疫实验课安排抗球蛋白试验（Antiglobulin Test，Co

17、ombs Test）某些血球凝集反应，如某些血球凝集反应，如Rh红细胞与抗红细胞与抗Rh抗体的反应，因抗体为抗体的反应，因抗体为IgG，结合价为两价，结合价为两价，与与IgM相比，分子较小，抗体与红细胞间的结合相比，分子较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现红细胞凝集力不能克服细胞间的排斥力，不出现红细胞凝集现象。若加入抗现象。若加入抗IgG的抗体，则可以在包被了的抗体，则可以在包被了Rh 抗体的红细胞之间建立数量较多、距离较抗体的红细胞之间建立数量较多、距离较远、因而排斥力较小的联接，引起凝集现象。远、因而排斥力较小的联接，引起凝集现象。35免疫实验课安排36免疫实验课安

18、排沉淀反应（Precipitation)血清、蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等血清、蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可可溶性抗原溶性抗原与相应与相应抗体抗体在电解质存在的条件下结合在电解质存在的条件下结合出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。大多沉出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。散故也称免疫扩散。37免疫实验课安排沉淀反应的分类38免疫实验课安排双向免疫扩散（Double Immunodiffusion)在琼脂板上按一定距离打两在琼脂板上按一定距离打两个小孔，将抗原与抗体分别加入个小孔，将

19、抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定本法常用于抗原或抗体的定性性、组成的检测。、组成的检测。39免疫实验课安排 在中间孔加入定量在中间孔加入定量的抗体，按一定距离在的抗体，按一定距离在四周打数个小孔，分别四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原，加入不同稀释度的抗原，可形成粗细不等的沉淀可形成粗细不等的沉淀线，从

20、而可判定抗体的线，从而可判定抗体的效价。效价。双向免疫扩散双向免疫扩散(Double Immunodiffusion)40免疫实验课安排定性实验定性实验 检测两种抗原的相关性检测两种抗原的相关性双向免疫扩散双向免疫扩散(Double Immunodiffusion)41免疫实验课安排单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)将一定量已知抗体混于琼将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中抗体相遇，形成

21、以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。含量成正比。本法常用于测定血清本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和和 C 3等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环42免疫实验课安排43免疫实验课安排对流免疫电泳(Counter Immunoelectrophoresis)在电场中进行的双向免疫扩散。在电场中进行的双向免疫扩散。AgAb电泳电渗44免疫实验课安排45免疫实验课安排电渗：电渗：电场中溶液相对于固体的移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动。46免疫实验课安排火箭电泳（Rocket Electrophoresis)-+47免疫实验课安排免疫电泳(immunoelectrophoresis)48免疫实验课安排