免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训课件.ppt

1、免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T T细胞数量和其功能检细胞数量和其功能检测测Part I 补体参与的反应补体参与的反应 补体的溶血反应补体的溶血反应 Part II T细胞数量及其功能检测细胞数量及其功能检测 E花环形成试验花环形成试验数量测定数量测定 淋巴细胞转化试验：淋巴细胞转化试验：形态学方法形态学方法 3HTDR掺入法掺入法 MTT比色法比色法 功能功能2免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 补体激活的三条途径补体激活的三条途径经典途径经典途径MBL途径途径旁路途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基病原体配基细菌细菌+C3膜攻击复合物

2、膜攻击复合物细胞溶解细胞溶解Part I 补体参与的反应补体参与的反应复习复习3免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测1.补体的溶血反应补体的溶血反应 原理原理 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）作为抗原与其相应抗体）作为抗原与其相应抗体（溶血素）（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应溶血反应。u材料材料 1抗原：抗原：2%绵羊红细胞；绵羊红细胞；2抗体抗体(溶血素溶血素)；3补体：健康豚鼠新鲜血清补体：健康豚鼠新鲜血清 4生理盐水、生

3、理盐水、24孔板等。孔板等。4免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测孔号孔号 SRBC溶血素溶血素补体补体NS13滴滴3滴滴3滴滴3滴滴23滴滴3滴滴6滴滴33滴滴3滴滴6滴滴43滴滴9滴滴 步骤步骤1 1、取、取2424孔板，按下表加入各成分；孔板，按下表加入各成分；2 2、将、将2424孔板放在孔板放在3737温箱内温箱内15-30min15-30min，观察并记录结果。，观察并记录结果。结果结果:5免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测Part II T细胞数量及其功能检测细胞数量及其功能检测6免疫学补体参和

4、反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测2.E花环形成试验花环形成试验 原理原理 人外周血人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体表面糖肽相结合的受体E受体（受体（CD2分分子），可结合子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是形成花环样细胞团，是T细胞细胞特有的表面标志。特有的表面标志。检测检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。7免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 步骤：步骤：（动作轻柔；分清滴管及枪头！）（动作轻柔；分

5、清滴管及枪头！）取肝素抗凝血与等量取肝素抗凝血与等量Hanks液稀释混匀血液稀释混匀血3ml，用，用滴管贴管壁（倾斜滴管贴管壁（倾斜30）轻轻）轻轻叠加于叠加于3ml分离液上分离液上（界面要清晰）（界面要清晰）配平后配平后1800rpm离心离心13mins。1.淋巴细胞悬液的制备：淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞比重：人淋巴细胞比重：1.070淋巴细胞分层液：淋巴细胞分层液：1.077人红细胞比重：人红细胞比重：1.0929免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测稀释的血液稀释的血液 分层液分层液离心前离心前稀释的血浆稀释的血浆 单个核细胞单个核细胞分层液分

6、层液粒细胞粒细胞红细胞红细胞离心后离心后10免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测11免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 另取一支滴管，另取一支滴管，仔细仔细吸出位于血浆和分离液之吸出位于血浆和分离液之间的间的乳白色的单个核细胞乳白色的单个核细胞，放入盛有，放入盛有5mlHanks液的试管液的试管2000rpm离心离心5mins。(3)弃上清（弃上清（倾倒时液体不要回流倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入巴细胞轻弹混匀后加入Hanks液液5ml，重复离心重复离心两次。两次。2.弃去

7、上清，留经过洗涤的弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液淋巴细胞悬液（约（约0.1ml）与与绵羊红细胞绵羊红细胞0.1ml、1640营养液营养液0.1ml混合（混合（分分清枪头清枪头）轻弹混匀后放于轻弹混匀后放于37温箱温箱15mins。离心时要配平离心时要配平12免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测3.取出试管，取出试管，500rpm离心离心5mins。（注意此步非常。（注意此步非常关键，关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可可）,室温静置室温静置2-3mins4.吸去吸去100-150ul上清液，轻轻上清液，轻

8、轻旋转混匀旋转混匀，沿管壁沿管壁滴加滴加1滴滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5.取一滴（取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。液，加盖玻片。13免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测6.高倍镜下观察，计数高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合花环形成率。淋巴细胞上结合3个个SRBC者者为为E花环阳性。花环阳性。100%未形成花环细胞数形成花环细胞数形成花环细胞数E花环形成率(%)正常参考值：正常参考值：EtRFC：64.46.

9、7；EaRFC：23.63.5；EsRFC：3.32.614免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 结果结果T 淋巴细胞淋巴细胞SRBC15免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测16免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 原理原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大谢旺盛、蛋白

10、质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现淋巴细胞转化现象象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法三种方法 形态学方法、形态学方法、3H-TdR掺入法、掺入法、MTT比色法比色法17免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞

11、：成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；为轻度嗜碱性；过渡型淋巴细胞：过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；胞浆比较多，但是出现核仁；淋巴母细胞：淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁色疏松，有核仁12个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：其他细胞：中性粒细胞在培养中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。或死亡呈碎片。形态学方法形态学方法：镜下观察

12、镜下观察 淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验18免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 淋巴细胞转化率：淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞100正常参考值：正常参考值：80红细胞红细胞未转化淋巴细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验 瑞氏染色瑞氏染色 1040 19免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测20免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测3HTDR掺入法掺入法 淋

13、巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 T细胞受到细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可，可以被细胞摄入而掺入以被细胞摄入而掺入DNA中，通过中，通过-液体闪烁液体闪烁计数器计数器测定测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖的掺入量，判断细胞的增殖程度。程度。21免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测MTT比色法比色法 淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 MTT为一种黄色可溶性物质，细

14、胞活化增殖为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过时通过线粒体能量代谢线粒体能量代谢，将，将MTT代谢成蓝紫色代谢成蓝紫色的的甲臢甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下酶标仪下根据根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。22免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测 MTT Formazan Insoluble23免疫学补体参和反应免疫

15、学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测1.补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。2.E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。结果。3.绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察结果。结果。实验报告实验报告24免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测第第4 4次次 实验课内容实验课内容1.1.免疫标记技术：免疫标记技术：ELISAELISA2.2.免疫病理实验免疫病理实验3.3.实验课考试实验课考试25免疫学补体参和反应免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测细胞数量和其功能检测