免疫学检测和免疫学技术培训课件.ppt

1、免疫学检测和免疫学免疫学检测和免疫学技术技术一、概述一、概述 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。中的应用。免疫学技术的应用极为广泛免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。疗效评价及理论研究等。二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术 *根据反应的基本原理与表现主要分为凝集根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应反应、沉淀

2、反应和补体参与的各种反应 *根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原原(或抗体或抗体)检测相应物质的标记技术。检测相应物质的标记技术。免疫学检测和免疫学技术2 对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数计数及功能测定及功能测定(一一)细胞计数细胞计数1.荧光抗体染色荧光抗体染色2.免疫酶染色技术免疫酶染色技术:*ABC法法*APAAP法法3.免疫金银染色法免疫金银染色法(IGSS)4免疫细胞化学法免疫细胞化学法5四聚体法四聚体法6TCR 链测定链测定三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测 免疫学检测和免疫学技术3(二二)免疫细胞功能的

3、测定免疫细胞功能的测定 1.T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等缺陷，自身免疫病等 (1)细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验：试验：可分为非特异性丝可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有丝裂原主要有PHA、Con A和和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色和白色念珠菌等；念珠菌等；*同种同种MHC及抗及抗CD3单抗等单抗等 *肿瘤细胞肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养自体淋巴细胞混合培养 (2)T细胞介导的细胞毒试验：细胞介导的细胞毒试验：CTL (3)分泌功能检测分泌功能检

4、测 (4)T细胞功能的体内检测法细胞功能的体内检测法 *接 触 性 超 敏 反 应接 触 性 超 敏 反 应*移 植 物 抗 宿 主 反 应移 植 物 抗 宿 主 反 应(GVHR)*迟发型超敏反应迟发型超敏反应(DTH)免疫学检测和免疫学技术42.B细胞功能判定细胞功能判定(1)B细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验：试验：*PWM、SAC，LPS（对小鼠（对小鼠B细胞）；细胞）；*抗抗IgM抗体及抗体及EB病毒等病毒等(2)溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种是一种可检测抗体分泌细胞，又

5、可测定抗体分泌量的体可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。外实验方法。*此法的主要优点是此法的主要优点是:稳定、特异，且抗原用量少；稳定、特异，且抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；量测定；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。免疫学检测和免疫学技术53.NK细胞活性测定细胞活性测定 体外检测体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查细胞活性的方法有形态学检查法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人法及流式细胞术等。测定人

6、NK细胞活性常以细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活细胞活性常用性常用YAC1 细胞为靶细胞。细胞为靶细胞。(1)形态学检查法形态学检查法 (2)放射性核素释放法：用放射性核素放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125I UdR)标记靶细胞。标记靶细胞。(3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。活性。*NAG酶荧光比色法酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶一种溶酶体酶,与其底物作用后与其底物作用后,生成荧光产物生

7、成荧光产物,应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。性好。免疫学检测和免疫学技术6(4)化学发光法化学发光法(5)流式细胞术：应用流式细胞术：应用FCM检测检测NK细胞活性是细胞活性是根据根据PI染料排斥法。染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与渗入死亡细胞内与DNA和和RNA结合，在结合，在488nm波长激发下产生绿色荧波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料

8、法还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。免疫学检测和免疫学技术7 4吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定(1)中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗透法透法(Boyden小室法小室法)或琼脂糖平板法。或琼脂糖平板法。(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定1)显微镜检法显微镜检法2)NBT试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。杀菌功能的一种简易方法。3)化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程

9、中化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发出现呼吸爆发,产生活性氧代谢产物。此类活性产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。能激发细胞内某些物质产生化学发光。免疫学检测和免疫学技术8(4)巨噬细胞细胞毒测定巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以噬细胞，以-干扰素为激活剂使其活化，作干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用为效应细胞。用125I-UdR标记的标记的DBA/2小鼠小鼠肥大细胞瘤肥大细胞瘤P815作为靶细胞。作为靶细胞。(3)巨噬细胞吞噬功能测定：中

10、药斑蝥酒精浸巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑蝥酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功能的指标。巨噬细胞吞噬功能的指标。免疫学检测和免疫学技术9 四、细胞因子的检测四、细胞因子的检测（一）免疫学检测法（一）免疫学检测法 免疫学检测的基本原理是将细胞因子作免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、法、RIA法和免疫印迹法等

11、均已用于法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品样品(如脑脊液如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应可用免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)进行检测。进行检测。免疫学检测和免疫学技术10（二）生物学测定法（二）生物学测定法 根据细胞因子对特定的生物学活性根据细胞因子对特定的生物学活性,应用应用相应的指示系统相应的指示系统,同时与标准品对比测定同时与标准品对比测定,从而从而得知样品中细胞因子的活性水平得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性一般以活性单位单位(U/ml)表示。表示。靶细胞可直接从组织中分离靶细胞可直接从组织中分离,如骨髓

12、细胞的如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞脾细胞)的增殖试验的增殖试验,或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞。靶细胞。免疫学检测和免疫学技术11 1.促进细胞增殖和增殖抑制法促进细胞增殖和增殖抑制法 *多种多种IL、表皮生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子 *各种各种CSF作用

13、于造血系统的不同细胞作用于造血系统的不同细胞,可可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培养骨髓细胞的集落形成养骨髓细胞的集落形成,故可采用集落形成试验故可采用集落形成试验研究研究CSF的水平的水平 *常用的检测细胞增殖的方法有常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和和NAG等方法。等方法。免疫学检测和免疫学技术12 2.细胞毒活性测定法细胞毒活性测定法 许多细胞因子许

14、多细胞因子(TNF)针对转化的细针对转化的细胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制细胞生长的活性。细胞生长的活性。免疫学检测和免疫学技术13 3.抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株有常用于检测抗病毒活性的细胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和和MDBK等。其中等。其中WISH和和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素细胞株用以检测人干扰素,L929细胞株用于检测小鼠干扰素细胞株用于检测小鼠干扰素,Ratec细胞株用于细胞株用于检测大鼠干扰素检测大鼠干扰素,而而MDBK细胞株则可用于检细胞株则可用于检测多种族的测多种族的IFN-

15、和和IFN-。常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒(VSV)、鼠脑心肌炎病毒、鼠脑心肌炎病毒(EMCV)以及以及Sindbis virus等病毒。等病毒。检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。斑形成或抑制病毒的产量等。免疫学检测和免疫学技术14 4.趋化活性测定法趋化活性测定法 多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱导中性粒细胞、单核导中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞定巨噬细胞和淋巴细胞定向

16、迁移向迁移 趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化性和化学增活现象。性和化学增活现象。趋化性趋化性(chemotaxis)是指诱导细胞向趋化是指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向作定向移动因子化学浓度高的方向作定向移动,可采用琼可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋化活性；化活性；化学增活现象化学增活现象(chemokinesis)是指增强是指增强细胞的随机运动细胞的随机运动,可采用琼脂糖小滴化学动力可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。学试验检测。免疫学检测和免疫学技术15(三三)分子生物学测定法分子生物学测定法 RN

17、A印迹法、核酸酶保护分析、原印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、位杂交、PCR和和Real Time PCR等。亦可等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。量，推算出细胞因子的合成量。免疫学检测和免疫学技术16(四四)单个细胞产生细胞因子测定法单个细胞产生细胞因子测定法 常用的方法有反向溶血空斑试验常用的方法有反向溶血空斑试验(RHPA)和反向和反向ELISA斑点试验斑点试验 (1)反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验(RHPA):RHPA是一种体外检测抗体分泌细胞的试验是一种体外检测抗体分泌细胞的试验,亦亦可用于检测细胞因子。

18、可用于检测细胞因子。(2)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT):所所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对细用的包被抗体与酶标抗体应分别针对细胞因子的不同抗原决定簇胞因子的不同抗原决定簇免疫学检测和免疫学技术17(五五)细胞内细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测 采用采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子平检测不同细胞亚群中的细胞因子,用两用两种标记的荧光抗体可在一种细胞内同时种标记的荧光抗体可在一种细胞内同时测定两种不同的细胞因子。测定两种不同的细胞因子。免疫学检测和免疫学技术18 细胞因子受体检测的基本技术细胞因子受体检测的基本技术

19、细胞因子的广泛生物学活性是通过与细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。个重要内容。免疫学检测和免疫学技术19 五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测 某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样

20、检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。品中的含量。免疫学检测和免疫学技术20 六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析*包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。技术等。杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物放射性核素或其他标记物(生物素、荧光素、生物素、荧光素、地高辛等地高辛等)标记，并与目的基因互补的标记，并与目的基因互补的DNA片片段或单链段或单链DNA、RNA。分为。分为cDNA探针、寡核探针、寡核苷酸探针、基因组苷酸探针、

21、基因组DNA探针及探针及RNA探针等。探针等。*核酸探针技术的操作主要包括：质粒核酸探针技术的操作主要包括：质粒DNA的提取；靶的提取；靶DNA片段的分离；靶片段的分离；靶DNA片片段的标记；待测样品段的标记；待测样品mRNA的提取；标记的提取；标记cDNA探针与待测样品进行杂交；放射自显探针与待测样品进行杂交；放射自显影或显色分析。影或显色分析。免疫学检测和免疫学技术21(一一)细胞因子基因组细胞因子基因组DNA或或mRNA的检测的检测 1.Northern杂交分析杂交分析 2.斑点杂交法斑点杂交法 3.原位杂交法原位杂交法 4.PCR扩增产物杂交分析扩增产物杂交分析 是将细胞因子的是将细胞

22、因子的mRNA经过逆转录为经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因，用特异性细胞因子引物进行子引物进行PCR扩增，通过扩增，通过Southern blot后，后，再用标记探针检测特异细胞因子再用标记探针检测特异细胞因子DNA的水平。的水平。5Southern印迹杂交印迹杂交 6.斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交:将将DNA变性后直接变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交点样于硝酸纤维膜上再进行杂交 7.细胞因子细胞因子mRNA表达的测定还可采用表达的测定还可采用RT-PCR、原位杂交与原位、原位杂交与原位PCR,RNA半寿期半寿期的检测的检测,进行中的转录分析等。进行中的转录分析等。免疫学检测

23、和免疫学技术22(二二)BCR及及TCR克隆性基因重排分析克隆性基因重排分析 1Southern印迹杂交法：仅适用于科研，印迹杂交法：仅适用于科研，而不适用于临床诊断。而不适用于临床诊断。2.PCR扩增技术扩增技术:正常多克隆淋巴细胞群正常多克隆淋巴细胞群DNA的扩增产物含有不同长度的片段，电泳的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经隆性基因重排经PCR扩增后，产生明显相同扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构 *应用应用PCR 扩增技术进行基因诊断具有

24、扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感特异、敏感(1/1041/105克隆性细胞克隆性细胞)、快速、快速(24h可完成可完成)等优点。等优点。*用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。免疫学检测和免疫学技术23(三三)HLA基因分型技术基因分型技术 1序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前应用最多是目前应用最多的一种简单、快速而又精确的的一种简单、快速而又精确的HLA-类抗原分类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的型方法，能鉴定

25、所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析等位基因，精确地分析DNA的多态性。的多态性。2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术：技术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。3单链构象多态性单链构象多态性PCR（PCR-SSCP）：藉）：藉此可鉴别编码此可鉴别编码HLA-类抗原基因的多态性。类抗原基因的多态性。应用应用PCR-SSCP可以直接比较供、受体之间可以直接比较供、受体之间HLA-类基因是否完全一致，且可精确到类基因是否完全一致，且可精确到1 2个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点。在个碱基之差，具

26、有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。免疫学检测和免疫学技术24 4序列特异性引物序列特异性引物PCR技术技术(PCR-SSP)：该：该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。等位基因必须用多个引物进行扩增。5指纹图谱指纹图谱(PCR-fingerprinting)技术技术|：进：进行行HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的基因分型鉴定时，将供、受体的DNA扩增产物混合，电泳后得

27、出一指纹图，再与二扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的者各自的PCR指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植。指纹图一致的供、受体进行移植。*PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。间。6.SNP(单个核苷酸多态性单个核苷酸多态性)分析分析 (四四)补体基因分析补体基因分析 (五五)抗体基因分析抗体基因分析 (六六)细胞膜分子基因分析细胞膜分子基因分析免疫学检测和免疫学技术25 七、免疫标记技术七、免疫标记技术(一一)免疫

28、荧光技术免疫荧光技术 (二二)放射免疫分析法放射免疫分析法 (三三)酶免疫技术酶免疫技术 (四四)发光免疫测定发光免疫测定免疫学检测和免疫学技术26 八、免疫八、免疫PCR(IM-PCR)技术技术 免疫免疫PCR是将抗原抗体的特异性反应与是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来技术结合起来,用以检测微量蛋白质的方用以检测微量蛋白质的方法。免疫法。免疫PCR是用是用DNA分子标记特异性抗体，分子标记特异性抗体，利用利用PCR可大量扩增可大量扩增DNA片段的特点，从而将片段的特点，从而将检测灵敏度大大提高，最低检测值可达检测灵敏度大大提高，最低检测值可达10-21mol/L。1.直接免疫直接免

29、疫PCR 是将抗原包被在固相载是将抗原包被在固相载体上体上,用特异性单抗结合此抗原用特异性单抗结合此抗原,再用生物素化再用生物素化抗体通过亲合素连接生物素化抗体通过亲合素连接生物素化DNA,然后将后然后将后者进行者进行PCR 2.间接免疫间接免疫PCR 系将所测物的单抗包被系将所测物的单抗包被在固相载体上在固相载体上,然后使所测抗原与之结合然后使所测抗原与之结合,再将再将特异性抗体生物素化特异性抗体生物素化,并通过亲合素连结生物素并通过亲合素连结生物素化化DNA分子而将后者进行分子而将后者进行PCR 免疫学检测和免疫学技术27 九、新型抗体的制备技术九、新型抗体的制备技术(一一)对鼠源性抗体的

30、改造对鼠源性抗体的改造 1人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体(chimeric antibody)：鼠源性单抗的鼠源性单抗的V区，人免疫球蛋白的区，人免疫球蛋白的C区。区。免疫学检测和免疫学技术28 2人源化抗体人源化抗体 将鼠抗体的互补决定区将鼠抗体的互补决定区(CDR)与人与人IgFR和和C连接构建连接构建“人源化抗体人源化抗体”。(1)模板替换模板替换:使用与鼠对应部分有较大同源使用与鼠对应部分有较大同源性的人性的人FR替换鼠替换鼠FR区区,例如可通过例如可通过CDR移植移植构建构建“改型抗体改型抗体”(2)表面重塑表面重塑:对鼠对鼠CDR及及FR表面残基进行表面残基进行重塑或镶饰重塑或镶饰,使

31、之类似于人抗体使之类似于人抗体CDR的轮廓或人的轮廓或人FR的型式。的型式。(3)补偿变换补偿变换:在人在人FR选择与选择与CDR有互补作有互补作用、与抗体的亲和力有密切关系或对用、与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结空间结构折叠起关键作用的残基进行改变构折叠起关键作用的残基进行改变,以补偿完全以补偿完全的的CDR移植移植 (4)定位保留定位保留:通过计算机模建从现有的人源通过计算机模建从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠抗体保守序列中搜寻与鼠FR区最类似的序列区最类似的序列,根根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基,并保留所有这些位置而将其余部分进

32、行人源化。并保留所有这些位置而将其余部分进行人源化。免疫学检测和免疫学技术293.小分子抗体小分子抗体 (1)ScFv：由：由VH和和VL中间连以中间连以14 15个小肽个小肽,常用的连接肽为常用的连接肽为(Gly4Ser)3 (2)VH与与VL适当部位各引入一个半胱氨酸形适当部位各引入一个半胱氨酸形成以二硫键固定的成以二硫键固定的Fv段而构成的段而构成的DsFv(3)将将ScFv中两个可变区之间的接头缩短中两个可变区之间的接头缩短,使两使两分子间分子间VH和和VL配对形成双价小分子抗体配对形成双价小分子抗体(Diabody)(4)将两种不同特异性的将两种不同特异性的V基因交叉配对基因交叉配对

33、,则可则可得到双特异性得到双特异性Diabody(5)在在ScFv的一端加上一个双聚化结构亦可构建的一端加上一个双聚化结构亦可构建不同类型的双价或双特异性小分子抗体不同类型的双价或双特异性小分子抗体,如如Minibody等等免疫学检测和免疫学技术30(四四)细胞内抗体细胞内抗体*细胞内抗体是指在细胞内合成并作用于细胞内细胞内抗体是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体组分的抗体,亦称为内抗体亦称为内抗体(intrabody)。*若在抗体基因的若在抗体基因的N端或端或C端加入引导序列就能端加入引导序列就能使抗体表达定位亚细胞部位使抗体表达定位亚细胞部位,如胞浆、线粒体、如胞浆、线粒体、内质网或细

34、胞核部位。内质网或细胞核部位。*若在细胞内表达特异识别与肿瘤发生有关的癌若在细胞内表达特异识别与肿瘤发生有关的癌基因编码的抗体基因编码的抗体,即可抑制癌基因编码产物的表即可抑制癌基因编码产物的表达达,可用于肿瘤的治疗。可用于肿瘤的治疗。*细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗*抗抗EGFR胞外区的胞外区的ScFv-R IR,并在并在ScFv-R IR的的C-末端连接末端连接KDEL肽肽,提供提供ER滞留滞留 免疫学检测和免疫学技术32(五五)基因工程抗体衍生技术基因工程抗体衍生技术 1双特异性抗体双特异性抗体(BsAb)或称双功能抗体或称双功能抗体(BfA)。2.抗体的抗

35、原化技术：借助人源化抗体的抗体的抗原化技术：借助人源化抗体的构建方法，以抗体构建方法，以抗体V区作为分子载体来表达生区作为分子载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，即抗原化物学相关的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗体抗体(antigenized antibody,AbAg)。3抗体重组免疫毒素抗体重组免疫毒素 4.催化抗体催化抗体(catalytic antibody)或抗体酶或抗体酶(abzyme)：将催化活性引入抗体的结合部位：将催化活性引入抗体的结合部位,产产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质,称为抗体称为抗体酶或程序性酶酶或程序性酶(programm

36、able enzyme)。免疫学检测和免疫学技术33十、杂交瘤技术与十、杂交瘤技术与T细胞克隆技术细胞克隆技术 一一、杂交瘤技术杂交瘤技术 1.B细胞杂交瘤技术与单抗的制备细胞杂交瘤技术与单抗的制备 2.T细胞杂交瘤技术与其功能的研究细胞杂交瘤技术与其功能的研究二二、T细胞克隆技术细胞克隆技术 *按其特异性分为抗原特异性和非特异性按其特异性分为抗原特异性和非特异性T细细胞克隆。胞克隆。*按其功能则可分为辅助性和细胞毒性按其功能则可分为辅助性和细胞毒性T细胞细胞克隆。克隆。(一一)抗原特异性抗原特异性T细胞克隆细胞克隆 (二二)抗原非特异性抗原非特异性T细胞克隆的制备细胞克隆的制备 (三三)同种

37、反应性同种反应性TH和和CTL克隆的制备克隆的制备 (四四)肿瘤抗原特异性肿瘤抗原特异性CTL克隆克隆 免疫学检测和免疫学技术34 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测一、概述一、概述细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物体内无用是生物体内无用的、老化的一些损伤细胞自动死亡的一的、老化的一些损伤细胞自动死亡的一种形式，是指在一定的生理和病理情况种形式，是指在一定的生理和病理情况下下,机体为维护内环境的稳定机体为维护内环境的稳定,通过基因调通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。控而使细胞自动消亡的过程。免疫学检测和免疫学技术35二、细胞凋亡与细胞坏死的区别二、细胞凋亡与细胞坏死的区别*细胞坏

38、死是细胞膜细胞坏死是细胞膜,线粒体膜结构、流动性、线粒体膜结构、流动性、渗透性及受体等均受损渗透性及受体等均受损,进而细胞溶解、坏死；进而细胞溶解、坏死；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变；*细胞坏死时细胞坏死时,ATP和蛋白质合成抑制及终止和蛋白质合成抑制及终止;细细胞凋亡时胞凋亡时,ATP、mRNA和蛋白质合成依旧和蛋白质合成依旧,细胞细胞第二信号系统仍活动第二信号系统仍活动;*细胞坏死时细胞坏死时,细胞细胞DNA随机降解随机降解,电泳不呈梯状电泳不呈梯状图谱图谱;细胞凋亡时细胞凋亡时,DNA多降解成多降解成180200bp或或其倍数的梯状片段其倍数

39、的梯状片段,电泳呈梯状图谱电泳呈梯状图谱;*细胞坏死时细胞坏死时,细胞内容物外溢细胞内容物外溢,引起局部炎症反引起局部炎症反应或组织损伤应或组织损伤;细胞凋亡时细胞凋亡时,细胞内容物不外溢细胞内容物不外溢,所以不引起炎症反应或局部损伤所以不引起炎症反应或局部损伤;*细胞坏死时细胞坏死时,往往是成团细胞死亡往往是成团细胞死亡;细胞凋亡时细胞凋亡时,在组织中呈分散状态分布。在组织中呈分散状态分布。免疫学检测和免疫学技术36三、研究细胞凋亡的意义三、研究细胞凋亡的意义1.细胞凋亡在肿瘤形成和治疗中具有重要作细胞凋亡在肿瘤形成和治疗中具有重要作用。用。*凋亡基因与抗凋亡基因突变凋亡基因与抗凋亡基因突变

40、 易形成肿瘤；易形成肿瘤；*免疫效应细胞表达免疫效应细胞表达FasL,肿瘤细胞表达肿瘤细胞表达Fas诱导肿瘤细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡 抗肿瘤抗肿瘤*肿瘤细胞高表达肿瘤细胞高表达FasL诱导免疫细胞凋亡诱导免疫细胞凋亡 抑制免疫功能抑制免疫功能逃避免疫监视逃避免疫监视*肿瘤细胞低表达或不表达肿瘤细胞低表达或不表达Fas 逃避免疫监视逃避免疫监视 免疫学检测和免疫学技术372.细胞凋亡与免疫学的关系细胞凋亡与免疫学的关系*细胞凋亡与细胞凋亡与T细胞在胸腺的发育细胞在胸腺的发育*细胞凋亡与成熟细胞凋亡与成熟T细胞：细胞：AICD*细胞凋亡与与细胞凋亡与与B细胞细胞*细胞凋亡与胞毒效应细胞凋亡与胞毒效

41、应3.细胞凋亡参与自身免疫病的发生细胞凋亡参与自身免疫病的发生4.细胞凋亡与病毒感染细胞凋亡与病毒感染*抗病毒免疫防御抗病毒免疫防御*细胞凋亡与细胞凋亡与AIDS*细胞凋亡与病毒性肝炎细胞凋亡与病毒性肝炎免疫学检测和免疫学技术38 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法 一、形态学方法一、形态学方法 1普通光学显微镜检测法普通光学显微镜检测法 2荧光显微镜检测法荧光显微镜检测法 材料：石蜡切片材料：石蜡切片;冰冻切片冰冻切片;细胞学涂片。细胞学涂片。方法一：方法一：PI染液：碘化丙啶染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；DAPI染液；染液；AO染液：染液：*荧光显微镜下观察。

42、荧光显微镜下观察。PI染色选用染色选用600nm的的激发光激发光,DAPI选用选用460500nm的激发光的激发光,AO染染色选用色选用520nm的激发光。的激发光。*HE染色核染色核DNA呈蓝色呈蓝色,而而PI染色呈红染色呈红色色,DAPI染色呈蓝白色染色呈蓝白色,AO染色呈黄绿色。凋亡染色呈黄绿色。凋亡细胞呈现核浓缩细胞呈现核浓缩,染色加深染色加深,或核染色质呈新月形或核染色质呈新月形聚集于核膜一边聚集于核膜一边;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体被细胞膜包绕大小不等的圆形小体被细胞膜包绕,即凋亡小体。即凋亡小体。免疫学检测和免疫学技术39方法二：方法二

43、：Hoechst 33342/PI双标记法双标记法 *在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的蓝在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的蓝色荧光比活细胞和非凋亡细胞都要强，色荧光比活细胞和非凋亡细胞都要强，其光散射能力则降低，将二者结合起来，其光散射能力则降低，将二者结合起来，可以很好地鉴定凋亡细胞。坏死细胞则可以很好地鉴定凋亡细胞。坏死细胞则由于由于PI复染，呈红色荧光。是目前细胞复染，呈红色荧光。是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。凋亡最满意的形态学分析方法。*样品来源样品来源 培养细胞或离体细胞制成培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液。的单个细胞悬液。免疫学检测和免疫学技术40方法三：碘化丙啶（方法三：碘

44、化丙啶（PI）和）和Hoechst 33342(HO)双染法双染法PI和和HO均可使用紫外光激发，其荧光均可使用紫外光激发，其荧光分别为红光和蓝光。对照活细胞的分别为红光和蓝光。对照活细胞的HO蓝色荧光最强，而早期凋亡细胞由于其蓝色荧光最强，而早期凋亡细胞由于其DNA降解和丢失，其降解和丢失，其HO蓝色荧光较弱，蓝色荧光较弱，也有很弱的也有很弱的PI红色荧光。晚期凋亡细胞红色荧光。晚期凋亡细胞PI红色荧光增强，坏死细胞红色荧光增强，坏死细胞PI红色荧光红色荧光最强，而最强，而HO蓝色荧光较弱。蓝色荧光较弱。免疫学检测和免疫学技术413凋亡小体的电镜观察凋亡小体的电镜观察 小体系由细胞小体系由细

45、胞膜卷曲、脱落形成的小泡膜卷曲、脱落形成的小泡,其内包含有完其内包含有完整的细胞器及核片段。整的细胞器及核片段。免疫学检测和免疫学技术42二、生物化学方法二、生物化学方法 电泳法电泳法 DNA梯带梯带(DNA ladder)。免疫学检测和免疫学技术43三、免疫学方法三、免疫学方法(ELISA法法)*细胞凋亡的发生细胞凋亡的发生,是由于内源性核酸内切是由于内源性核酸内切酶的激活酶的激活,核小体间区双链核小体间区双链DNA解开解开,产生产生单单/低聚核小体片段低聚核小体片段,而核小体而核小体DNA由于与由于与组蛋白组蛋白H2A、H2B、H3和和H4形成紧密复形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。合物

46、而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法采用双抗体夹心酶免疫法,应用小鼠抗应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体与核小体片段形成夹心结构片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶可特异性检测细胞溶解物中的单解物中的单/低聚核小体。低聚核小体。免疫学检测和免疫学技术44四、原位末端转移酶标记技术四、原位末端转移酶标记技术(TdT或或TUNEL)凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,核核DNA被切割成许多双链被切割成许多双链DNA片段以及高分子量片段以及高分子量DNA单链断裂点单链断裂点(缺口缺口),暴露出大量暴露出大量3羟基末端羟基末端,如如用用(TdT)将标记的将标记的-dUTP进行缺口末端标记进行缺口末端标记,则可则可原位特异地显示出凋亡细胞。原位特异地显示出凋亡细胞。(一一)荧光标记法荧光标记法 *采用美国采用美国Oncor公司公司ApopTag TM 试剂盒，试剂盒，或德国或德国Boehringer Mannheim公司公司In Situ Cell Death Detection试剂盒试剂盒 (二二)酶标记法酶标记法 *采用美国采用美国Oncor公司公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒试剂盒 免疫学检测和免疫学技术45