免疫印迹技术培训课件.ppt
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1、免疫印迹技术Western Blot基本原理 一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。2免疫印迹技术其基本过程主要有三个工序:1、将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离;2、将分离的组分转印到印迹膜上;3、对转印到印迹膜上的蛋白成分进行免疫学检测。1233免疫印迹技术Western Blot一般流程一般流程l蛋白样品的制备蛋白样品的制备l蛋白含量测定蛋白含量测定l蛋白质变性蛋白质变性lSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l免疫学检测免疫学检测l封闭l一抗杂交l二抗杂交
2、l底物显色l曝光、显影、定影4免疫印迹技术一一 蛋白样本制备蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础1、制备蛋白、制备蛋白样本样本的目的的目的 体外活性测定(活性测定(in vitro assay)免疫印迹杂交免疫印迹杂交(Immunoblot)免疫沉淀或共沉淀免疫沉淀或共沉淀(Immunoprecipitation)双向电泳(双向电泳(two-dimensional electrophoresis)电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析(EMSA)染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)5免疫印迹技术3、方法的选
3、择、方法的选择2、蛋白质的性质、分类与分布、蛋白质的性质、分类与分布种类:细胞、组织、微生物、酵母种类:细胞、组织、微生物、酵母亚细胞定位:亚细胞定位:胞浆、胞膜、胞核、细胞器胞浆、胞膜、胞核、细胞器性质:水溶、脂溶性质:水溶、脂溶其他:含量多少、分子量大小、磷酸化等其他:含量多少、分子量大小、磷酸化等自行配制抽提试剂自行配制抽提试剂,根据文献根据文献方方法或法或经验提取经验提取购买购买商品化试剂盒商品化试剂盒,按其说明书按其说明书的方法提取的方法提取6免疫印迹技术二二 细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备裂解样品裂解样品离心收集离心收集定量检测定量检测7免疫印迹技术1 1、组织或细胞破碎、组
4、织或细胞破碎u机械匀浆机械匀浆 组织分散机、玻璃组织分散机、玻璃u超声破碎超声破碎u反复冻融反复冻融 干冰反复于零下1520使之冻固,然后缓慢地融解,反复操作u低渗溶液低渗溶液 u去污裂解液去污裂解液 表面活性剂有阴离子型(如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等),阳离子型(如氧化苄烷基二甲基铵等)及非离子型(Triton X-100、Tirton X-114、吐温60及吐温80)等。8免疫印迹技术2、细胞裂解液、细胞裂解液表面活性剂表面活性剂缓冲液缓冲液蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它:其它:H2O、NaCl、等、等还原剂还原剂RIPA Buffer9免疫印迹技术Compan
5、y Logo2.1 缓冲液缓冲液 稳定稳定pH环境,使蛋白保持自然构象,增加溶解性。环境,使蛋白保持自然构象,增加溶解性。有有 Tris-HCl,HEPES(H+),MOPS等体系(等体系(pH7.5)2.2 表面活性剂表面活性剂 溶解膜与脂膜,溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白)溶解膜与脂膜,溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白)分为分为 1 阴离子型阴离子型:SDS,脱氧胆酸盐脱氧胆酸盐 2 阳离子型阳离子型:CPB和CTAB 3 双性离子型双性离子型:CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型非离子型:Brij系列、Triton-100、Nonidet P40、Tween 系列等10免疫
6、印迹技术2.3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解,使用前临时加入抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解,使用前临时加入11免疫印迹技术 2.4 磷酸酶抑制剂选择磷酸酶抑制剂选择 抑制磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化,抑制磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化,使用前临时加入使用前临时加入磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶,酸性磷磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶,酸性磷酸酶),特异性的丝氨酸酸酶),特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(例如:苏氨酸磷酸酶(例如:PP1,PP2A,PP2B)、酪氨酸蛋白磷酸酶(例如:、酪氨酸蛋白磷酸酶(例
7、如:PTP)。)。常规的抑制剂主要包括:常规的抑制剂主要包括:试剂名称试剂名称抑制作用抑制作用氟化钠氟化钠酸性磷酸酶,丝氨酸酸性磷酸酶,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶苏氨酸磷酸酶正钒酸钠正钒酸钠碱性磷酸酶,酪氨酸蛋白磷酸酶碱性磷酸酶,酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠焦磷酸钠丝氨酸丝氨酸-苏氨酸磷酸苏氨酸磷酸 12免疫印迹技术.防止蛋白质发生氧化,保护二硫键。防止蛋白质发生氧化,保护二硫键。DTT、巯基巯基乙醇等。乙醇等。水;溶剂水;溶剂;NaCl。超纯水的电阻率就是单位厘米内的水的电阻值。即18.25M*CM.13免疫印迹技术2.7 全蛋白抽提时注意事项全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘可以适量加入甘油油,稳定
8、蛋白稳定蛋白注意事项注意事项可以适量加入可以适量加入Benzonase/DNase I等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent的种的种类类 纯度纯度 浓度浓度 干干扰扰 去除等因素去除等因素Temperature 试剂和器皿冰上试剂和器皿冰上预冷预冷,低温低温4操操作作细胞或组织的样细胞或组织的样本量本量l裂解液的用量裂解液的用量14免疫印迹技术2.8 细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点15免疫印迹技术三三 蛋白样本制备产品选择蛋
9、白样本制备产品选择16免疫印迹技术1、核蛋白样本制备、核蛋白样本制备抽提原理抽提原理l低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与释放出胞浆蛋白与胞核胞核;l离心分离出胞核离心分离出胞核;l高渗破裂胞核高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白释放出可溶性核蛋白;l加核酸酶降解加核酸酶降解DNA,释放出释放出DNA结结合蛋白合蛋白(组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子)实验注意事项实验注意事项l试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷l裂解液的用量裂解液的用量l细胞总量细胞总量l抑制蛋白酶:蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶:蛋白酶抑制剂17免疫印迹技术2、膜蛋白样本制备、膜蛋白样本制备18免疫印迹技术3、亚细胞分级抽提
10、、亚细胞分级抽提l 用用超离心技术超离心技术分离出分离出细胞细胞器、质膜和细胞核器、质膜和细胞核等成分,等成分,再用适当的蛋白质溶解液再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅进行溶解。其优点是不仅大大大大减少样品的复杂性减少样品的复杂性,而且可对分离的蛋白质进而且可对分离的蛋白质进行行亚细胞定位亚细胞定位。但该法需。但该法需要专业仪器,有时会出现要专业仪器,有时会出现假阳性。假阳性。l 根椐根椐胞浆胞浆/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白蛋白的亚细胞策略用不同的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解提取液逐级溶解19免疫印迹技术四种亚细胞组分分离提取的结果四种亚细胞组分分离提取的结果20免疫印迹技术
11、5、其它蛋白抽提产品、其它蛋白抽提产品l高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒l信号蛋白提取试剂盒信号蛋白提取试剂盒l糖蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒l细菌蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒l酵母蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒l植物蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒21免疫印迹技术四四 蛋白定量产品选择指南蛋白定量产品选择指南22免疫印迹技术1、BCA法蛋白定量法蛋白定量l BCA(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠,对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。l 原理是,在碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与B
12、CA试剂形成紫色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。l BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中,低浓度的去垢剂SDS,Triton X-100,Tween不影响检测结果,但螯合剂(螯合剂(EDTAEDTA,EGTAEGTA)、还原剂()、还原剂(DTTDTT,巯基乙醇)和脂,巯基乙醇)和脂类类会对检测结果有一定影响。l 实验中,若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高,可试用Bradford法测定蛋白浓度。23免疫印迹技术2、Bradford法蛋白定量法蛋白定量l 考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结
13、合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。l 原理:染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。l 测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。l 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。l 去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)干扰此法的测定。24免疫印迹技术3、Lowe
14、ry法蛋白定量法蛋白定量l Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法。l 原理:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。l 这个测定法的优点是灵敏度高,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。DC Protein Assay25免疫印迹技术免疫印迹(免疫印迹(Western Blot)二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封
15、闭转膜转膜SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺电泳酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影26免疫印迹技术五、蛋白质变性2SDS电泳上样缓冲液:1M Tris-base(pH 6.8)2.5ml,-巯基乙醇 1.0ml,SDS 0.6 g,甘油 2.0ml,0.1%溴酚兰 1.0ml,ddH2O 3.5ml。总体积:10ml 加一倍体积的上样缓冲液,95 27免疫印迹技术六、六、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠(十二烷基磺酸钠(SDS)是一种离子性的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当当
16、SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用而以硫酸根离子外露与水分子作用.蛋白质结合固定比例之蛋白质结合固定比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原先的带使蛋白质原先的带电价微不足道电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density),所以决所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。1、原、原 理:理:28免疫印迹技术2 2、S
17、DS-SDS-蛋白质复合物的特点蛋白质复合物的特点(1)具有相同的形状,形状像 一个 长椭圆棒。(2)平均1 g 蛋白质结合1.4 g SDS(3)短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。(4)长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。29免疫印迹技术3 3、支持体:聚丙烯酰胺(、支持体:聚丙烯酰胺(AcrAcr和和BisBis)聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和丙烯酰胺和N N,N N亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比碳聚合物
18、,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易和样品相互作用。较小,不易和样品相互作用。在水溶液中,单体和交联剂通过在水溶液中,单体和交联剂通过自由基自由基引发的引发的聚合反应聚合反应形成凝胶形成凝胶 。常用的引发剂和加速剂是常用的引发剂和加速剂是过硫酸氨过硫酸氨(AP)(AP)和和 N N,N N,N N,N-N-四甲基对乙二胺四甲基对乙二胺(TEMED)(TEMED)。浓度可在浓度可在7.5%-15%7.5%-15%之间变化。之间变化。温度高聚合快,温度低聚合慢。温度高聚合快,温度低聚合慢。30免疫印迹技术凝胶成份凝胶成份M丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和N,NN,N-亚甲双
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