免疫共沉淀原理和注意事项培训课件.ppt

1、免疫共沉淀原理和注意事项CO-IP应用与IP区别v测定两种目标蛋白质是否在体内结合v确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）2免疫共沉淀原理和注意事项实验基本原理v 1.提取蛋白v 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体v 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上)若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“YX抗X抗体Protein A或Gv 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合agaros

2、e bead 琼脂糖珠3免疫共沉淀原理和注意事项CO-IP原理图解4免疫共沉淀原理和注意事项proteinA/G-琼脂糖珠复合物v Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。v 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。5免疫共沉淀原理和注意事项ProteinA/G的作用及具体原理v“捕获”抗体，形成复合物，抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合v 加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beadsv E

3、P管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。6免疫共沉淀原理和注意事项二 CO-IP特征优点（1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态（2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物7免疫共沉淀原理和注意事项二 CO-IP特征局限性（1 可能检测不到低亲和力和瞬间低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；（3 必须在实验前预测目的蛋白预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。8免疫共沉淀原理和注意事项 三 实验流程

4、提取细胞总蛋白 离心，上清电泳(抗原抗体)准备PAPA珠子，PBSPBS洗3 3遍 PA PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)离心去PAPA珠子，取上清 测蛋白浓度(BCA(BCA法)加一抗反应(4(4过夜)加PAPA珠子捕捉复合物(室温1h1h或44过夜)离心，收集沉淀，预冷RIPA BufferRIPA Buffer洗3 3遍 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 9免疫共沉淀原理和注意事项SDS-PAGE结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率 以每个蛋白标准的分子量

5、对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。11免疫共沉淀原理和注意事项一抗一抗一抗一抗(兔抗兔抗Actin)曝光后的蛋白条带曝光后的蛋白条带二抗二抗(辣根酶标记的羊抗兔辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影光片曝光显影ECL 试剂试剂含有转印蛋白的含有转印蛋白的PVDF膜膜+转印膜上蛋白检测示意图转印膜上蛋白检测示意图 WB结果分析结果分析12免疫共沉淀原理和注意事项CO-IP与质谱分析流程13免疫共沉淀原理和注意事项三 实验的关键v 1.实验最需要注意点就是抗体的性质抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。v 2.为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液

6、必须加蛋白酶抑制加蛋白酶抑制剂剂，低温低温下进行实验。v 3.考虑抗体抗体/缓冲液的比例缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。v 4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位蛋白质的定位来确定。？14免疫共沉淀原理和注意事项注意的问题：1.裂解液v 细胞裂解采用温和温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。v 不能用高浓度的变性

7、剂（0.2SDS)，细胞裂解细胞裂解液中要加各种酶抑制剂液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。15免疫共沉淀原理和注意事项RIPA裂解液-普利莱基因技术有限公司v 100ml RIPA Buffer：50 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）说明：1.裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1mM1mM的的PMSFPMSF或其它蛋或其它蛋白酶抑制剂。白酶抑制剂。2.RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用用BCABCA法法或改良Lowry法测定蛋白浓度16免疫共沉淀原理和注意事项

8、裂解液成分 国内博士：细胞裂解液：50mM Tris-HC（lpH7.5），150 mM NaCl,0.5%NP-40,1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、proteinase inhibitor cocktail（混合物）。刘岩 BC300 buffer 20 mM Tris-Cl,pH 8.0,300mM NaCl,0.2 mM EDTA,10%glycerol（甘油甘油）,0.2 mM PMSF,0.2%Tween 2017免疫共沉淀原理和注意事项2.1免疫沉淀中抗体的选择18免疫共沉淀原理和注意事项注意的问题：2.2抗体v使用对照抗体对照抗体：（阴性和阳性）阴性：单克隆

9、抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）19免疫共沉淀原理和注意事项未检测到目得蛋白或蛋白很少 可能原因 处理方法v 1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4以下冰上操作并防止冻融v 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度v 3.抗抗体亲合力太低：选用适合于IP和/或IB的相应抗体v 4.IP抗体未与agarose珠子结合：选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥v 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位v 6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液20免疫共沉淀

10、原理和注意事项目得蛋白高背景：v 可能原因 处理方法v 非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）v 裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液v 实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体v 转移膜上的非特异吸附 戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面21免疫共沉淀原理和注意事项试剂vRIPA BufferRIPA Bufferv蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂（aprotininaprotinin、leupeptinleupeptin、pepstatinpepstatin）、）、PMSFPMSF。v洗涤缓冲液PBSvProtein A agarose琼脂糖v抗体22免疫共沉淀原理和注意事项仪器、耗材 摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干）23免疫共沉淀原理和注意事项24免疫共沉淀原理和注意事项