特异性微小RNAa抑制剂对胃癌细胞增殖影响系列培训课件.pptx

1、一、立一、立 项项 依依 据据(一)胃癌概述1.胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。2.全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位.3.早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。病变已属晚期。4.胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如如CEA灵敏度仅灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移，使肿瘤常常发生浸润转移5.肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞

2、伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物害较大，亟需高特异性的肿瘤药物(二二)微小微小RNA1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。2.微小RNA分子(micro RNA,miRNA)是非编码的RNA分子(noncoding RNA,ncRNA),对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用,研究miRNA的表达,尤其对其功能研究,对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。(三)胃癌组织中微小RNA的

3、表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表芯片分析胃癌组织中异常表达的微小达的微小RNAGuo J,et al.J Gastroenterol Hepatol.2009,24(4):652-657 19种差异表达的微小种差异表达的微小RNA 12 7 miR-139-5p，miR-497和和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和和miR-658首次在癌组织中发现高表达首次在癌组织中发现高表达 二、研究目标二、研究目标microRNA-19a 胃癌细胞 microRNA-19a？microRNA-19a抑制剂抑制剂 本课题主要研究特异性微小RNA

4、-19a的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。初步假设：特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。三、研究内容三、研究内容 设计并合成微小RNA-19a的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸（微小RNA抑制剂），用脂质体转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞，然后用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术检测微小RNA-19a的表达情况，最后用MTT法检测胃癌细胞的增殖情况。四、可行性分析 微小RNA的抑制剂由生物公司合成并购买 细胞转染实验以及MTT法技术都已普及 实时定量-PCR基础二楼生化教研室可进行本实验五、研究方案设计五、研究方案设计材料 胃癌细胞SGC-79

5、01和MGC-803（购于上海生化所细胞库）DMEM培养液（4C保存）胎牛血清 RNA提取Trizol法试剂 转染Lipofectamine 2000试剂 实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒 通用逆转录引物 针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物 微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸9.1 卖方应提供下列服务中的任一种或所有的服务：4.4坚持每班巡回检查，掌握安全生产情况，杜绝“三违”现象发生。(5)按本合同规定，及时向承包方支付各种费用。对新增的对外报表，由各部门提出方案，将表样送生产部审核、报批登记后方可对外报出。激励机制是激励活动要素在进行过程

6、中互相联系、相互作用、相互制约及激励效果之间内在联系的综合机能，其作用旨在提高“内聚力”。4、班长安全职责10.4 在质量保证期内，由于维修、更换有缺陷或损坏的货物或部件，其保证期将延长，延长时间等于停机时间。_3、中标通知书发出之日起30日内，按照招标文件确定的事项签订合同。招标文件、中标人的投标文件以及评审过程中的有关澄清、承诺文件均为合同的组成部分。一般说来，建立全面顾客服务制度需要完成八个步骤：环境评估、策略规划、领导决心、人事政策、服务设计、基础设施建设、衡量标准和管理考核。其中，环境评估所获得的信息是规划决策的基础，领导决心是制度成功建立的保证，而有效的挖掘出企业的独特资源往往是企

7、业创造服务差异化的制胜法宝。4.5.4典型事故案例及事故应急处理措施；18.1 投标人应提交证明其有资格参加投标和中标后有能力履行合同的文件,作为投标文件的组成部分。三工转换采用“绩效管理，计量到位，绩效连筹”的原则。这种管理方法能够促使员工产生竞争心理，从而提高工作效率。竞争会促进和改善生存质量，要让员工产生不安定、不安全的危机意识。为此，员工必须争夺工作机会，工作起来就会更认真。方法1、细胞培养 胃癌SGC-7901和MGC-803细胞在37度、含5%CO2的培养箱中培养。DMEM培养液中含有10%小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。2、细胞转染 转染前1d,选择生长状态良好的细胞胃癌细

8、胞，以3105cells/well的密度接种6孔板，待细胞密度达到50%-70%后，用lipofectamine 2000转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养4小时后新鲜培养液。3、细胞总RNA提取及实时定量RT-PCR检测微小RNA的表达水平 用Trizol试剂提取细胞内总RNA并测定RNA浓度，逆转录成cDNA，再按说明书进行实时定量PCR，以U6作为小RNA含量的参照。PCR反应条件为：先95度15min热启动，然后按94度15s、60度30s、72度30s，共40个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小RNA的相对表达量用 方法来表示，4、MTT法检测胃癌细胞增殖情况 以1.

9、5 104cells/well接种胃癌细胞于96孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小RNA抑制剂阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长差异，在确定前2组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用3个不同浓度（0.50mol/L0.7mol/L1.00mol/L）的微小RNA抑制剂转染细胞，每组设3个复孔。48h后492nm和630nm双波长下检测吸光度（A）值，每组取均值计算细胞抑制率。5、统计学处理 数据用SPSS13.0软件分析，两组间均数比较用独立样本t 检测，结果用均数标准差（Xs）表示。六、预期研究成果六、预期研究成果 特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小RN

10、A-19a的表达，抑制了胃癌细胞的增殖。七、经费预算七、经费预算 胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）两种试剂盒（购于生物公司）总费用约5800元八、参考文献八、参考文献 Tony Bou Kheir,Ewa Futoma-Kazmierczak,Anders Jacobsen Anders Krogh,Linda Bardram：miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer Zhang Chun-zhi,Han Lei,Zhang An-ling,Fu Yan

11、-chao,Yue Xiao,Wang Guang-xiu,Jia Zhi-fan1,Pu Pei-yu：RMeseiacrcrho arRticNleA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN 蒋振，郭俊明，肖丙秀：特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响(二二)微小微小RNA1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。2.微小RNA分子(micro RNA,miRNA)是非编码的RNA分子(noncodi

12、ng RNA,ncRNA),对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用,研究miRNA的表达,尤其对其功能研究,对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。三、研究内容三、研究内容（二）微缺陷的排除按下发部门的要求格式编制，纸张按内容多少可采用A4或8K纸。针对工厂的实绩与现状，明确制订5S的目的及目标、活动计划，并依计划采取阶段性推进，5S活动一开始是以谋求防止灾害及事故发生为目的，因此首先要以3S（整理、整顿

13、、清扫）为重点，其次才涵盖清洁及素养，当5S达到一定水准时，则通过小集团别、5S对象别及课题别进行目标管理。26.1 投标人在递交投标文件后，如果提出修改或撤回其投标的要求，但必须在投标截止期之前将修改或撤回的书面通知送达招标代理机构。3.标准与计量e.统计方法的选定必须满足工艺管理的要求，有助于工艺参数的优化，提高工艺技术水平和工艺改进。9.4 下列任何情况发生时，磋商保证金将被不予退还：竞争性磋商响应人递交响应文件前，应提交规定数额的磋商保证金，保证金金额为人民币40000元（肆万元）；磋商保证金递交截止时间为2016年5月16日下午3:00。利用电视品牌，终端展示材料，进行普遍宣传，使产

14、品信息迅速传播；各潜在投标人对招标文件如有疑问可要求澄清，要求澄清的潜在投标人应按照投标须知表第17项规定的时间和方式通知招标代理机构。招标代理机构将视情况确定采用适当的方式予以澄清或以书面形式予以答复，并在其认为必要时，将不标明查询来源的书面答复发给所有购买招标文件的潜在投标人。3.3 部门或相关工段服从调度室的生产协调指挥，在生产经营活动中严格执行调度室的各项调度指令，对本部门生产调度运行质量负管理责任；【案例】材料 胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）DMEM培养液（4C保存）胎牛血清 RNA提取Trizol法试剂 转染Lipofectamine 2000试剂

15、 实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒 通用逆转录引物 针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物 微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸 特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小RNA-19a的表达，抑制了胃癌细胞的增殖。八、参考文献八、参考文献2.5发现属于检验范围内的气瓶，应做出记号，通知气瓶产权单位进行检验确认。服务不是强制性的行为，它是发自内心的，自愿、自动、自发、主动性的行为。因此，必须创造一个组织氛围，来代替高压式的服务行为。植根式的服务文化正是满足了这种需求，其规划着眼于对企业服务观念、技术等各方面的全面性带动，严格强调全面参与。【自检】1定期检测的方式5、气体充装员安全职责3.3 国家建筑材料及非金属矿工业主要统计指标解释（6）具备履行合同所必需的设备和专业技术能力的证明材料（提供承诺函）；【案例】（1）实施或监督货物的运输、现场移动、安装和调试；加气站员工安全教育每3月考核一次；加气站、班组安全教育进行定期或不定期的考核，并做好考核纪录。4.3 本条规定不因本合同的终止和到期而失效。