硫酸软骨素的精制与纯化课件.ppt

1、1一、纯化的原因和意义二、提取过程中常用的纯化手段三、乙醇沉淀法在纯化中的应用四、乙醇与纤维素柱分级相结合的纯化应用五、季铵盐在纯化中的应用六、季铵盐与其他手段的结合在纯化过程中的应用七、盐溶液沉淀法八、离子交换法在纯化中的应用234除透明质酸外，蛋白聚糖是糖胺聚糖的天然存在形式，因此，组织消化液中会残留大量蛋白质及肽类；而在同一组织中，可能存在多种蛋白聚糖，后者又可能含有多种糖胺聚糖，而即便是同一糖胺聚糖，也可存在多种结构类型，因此，对经提取后的糖胺聚糖进行分级分离，是获得单一糖胺聚糖的必经之路。5硫酸软骨素类型硫酸软骨素类型二糖重复单元二糖重复单元来源来源AGlcA-GalAc4S牛软骨B

2、IdoA2S-GalNAc皮肤CGlcA-GalNAc6S鲨鱼软骨DGlcA2S-GalNAc6S海胆EGlcA-GalNAc4,6S乌贼6蛋白聚糖蛋白聚糖核心蛋白（核心蛋白（kDakDa)糖链数糖链数组织部位组织部位聚集蛋白聚糖208220100软骨多功能蛋白聚糖2651215纤维母细胞神经蛋白聚糖14512脑短小蛋白聚糖964脑饰胶蛋白聚糖361结缔组织二糖链蛋白聚糖3812结缔组织Bamacan13813基底膜-2(1X）胶原681软骨、玻璃体液血栓调节蛋白聚糖581内皮细胞CD443714淋巴细胞、膜NG225123神经细胞、膜丝甘蛋白聚糖10191015脊髓细胞7纯度：主要取决于纯化

3、的目的和应用的要求，一般医药工业并不一定要求产品结构的绝对均一，只要达到一定纯度即可活性：要求大分子保持天然构型状态，并具有高度的生物活性收率：希望收率越高越好，但在纯化过程中损失往往是不可避免的，而且纯化步骤越多，损失越大8纯化是获取糖链结构信息、探索其生物学功能及变化的前提纯度是商品内在价值重要体现，纯化是提高单位原料（如软骨）产出的手段纯化是减少过敏原的重要途径杂质的减少，可以有效改善产品色泽及其他感官品质910由于硫酸软骨素在组织中以蛋白聚糖的形式存在，因此，在提取过程中，组织经蛋白酶消化释放所有多糖后，消化液中仍会保留大小不同的蛋白和肽类物质，这类物质虽可在随后的纯化过程中予以去除，

4、但在提取过程中去除越充分，则越有利于进一步纯化。11三氯乙酸沉淀法磷钼酸磷钨酸沉淀法氯仿-丁醇/氯仿-戊醇沉淀法活性炭、Fullers、硅酸铝、高岭土吸附法等电点沉淀法超滤法12组织中的硫酸软骨素经碱解和/或蛋白酶水解后，提取液中可能存在各种糖胺聚糖和许多杂质如脂类、蛋白或肽类、色素以及无机盐等共存，因此必须采取合适的方法进行去除。纯化主要包括不同糖胺聚糖之间的分离，以及非糖胺聚糖类物质的分离常用的分级分离方法主要利用各种糖胺聚糖之间、以及硫酸软骨素与其他杂质在有机溶剂中溶解度的不同或者电荷密度的差异，分别采用乙醇沉淀法、盐液沉淀法、季胺盐络合法与离子交换色谱法等。1314乙醇沉淀法既可以回收

5、糖胺聚糖，也是一种简便的纯化方法软骨消化液，加入1.25倍体积的乙醇，即可沉淀近乎纯品的硫酸软骨素，而硫酸角质素和部分硫酸软骨素则保留在清液中一组性质相似的糖胺聚糖(如硫酸软骨素A、硫酸软骨素C及硫酸角质素），往往无法用季胺盐分开，则可以采用乙醇分级沉淀予以分离15分级沉淀时，每次加入的乙醇应视混合糖各成分的性质差异而定，通常级差益大些如已知或怀疑消化液中含有硫酸角质素，则益加大过量的乙醇以猪皮中硫酸软骨素和硫酸角质素分离为例，混合物先后通过18%、25%、40%、50%等乙醇浓度进行依次分离，其中硫酸角质素在前两浓度下沉淀，而硫酸软骨素则在高浓度下沉淀16粗消化液中所得的乙醇沉淀，常混有杂质

6、，利用水溶液或盐溶液进行复溶与沉淀，可以去除部分杂质，如部分变性蛋白重新溶解困难，可以离心去除1718混合多种糖胺聚调成分的硫酸软骨素溶液，采用乙醇沉淀往往需要几次反复才能获得良好的分离效果，如果各成分间的醇沉浓度差别不大、或者样品浓度较小时，则难度更大以多孔的化学惰性的纤维素柱为介质，继而以浓度逐步降低的乙醇进行洗脱，则可以克服上述醇沉的诸多不足19纤维素装柱平衡提取液上柱乙醇梯度洗脱50%乙醇洗脱液25%乙醇洗脱液硫酸角质素硫酸软骨素2021硫酸软骨素可以与一些阳离子洗涤剂如氯化十六烷基吡啶(CPC）和氯化十六烷基三甲铵（CTAB）形成沉淀，该沉淀又可在一定无机盐临界浓度下解离。各种糖胺聚

7、糖分子中可电离集团的位置、数量及连接方式的差异，使其与季胺基的亲和力不同，因此，使用不同浓度的盐可以将发生结合的糖胺聚糖阴离子分别取代下来，各种糖胺聚糖的最低解离盐浓度各有不同，据此可以将不同糖胺聚加以分离，从而使硫酸软骨素得以纯化22以下关于CPC的应用，大多同样适用于CTABCPC的质量各生产厂家有较大差异，如有必要，可以用水或丙酮重结晶予以纯化CPC水溶液在260nm有强烈吸收，因此本身也是一种灵敏而简便的检测方法CPC可配制成110%的水溶液糖的最适浓度在0.11%每沉淀一份糖可用三份CPC，最终混合液中游离CPC应不低于0.05%23CPC硫酸软骨素复合物需要经解离方可回收硫酸软骨素

8、，方法主要有以下三种1、复合物溶于盐溶液：用小于4mol/L的氯化钠，在40oC下不断搅拌解离，解离后加入35倍体积乙醇，硫酸软骨素沉淀析出，或向解离液中加入碘盐或硫氰酸盐，以去除季铵盐离子；解离液中的季铵盐离子也可用有机溶剂抽提去除242、季铵盐-硫酸软骨素复合物溶于有机溶剂：将复合物先经水洗涤除去无机盐后，37oC下加入丙酮或乙醇，所得溶液用不能溶于上述溶剂的无机盐，硫酸软骨素即可与加入的无机盐中的阳离子形成不溶性沉淀析出3、季铵盐-硫酸软骨素复合物充分粉碎后，用无机盐饱和的乙醇震荡数小时，复合物中季铵盐离子即与无机盐中的阳离子发生交换，不溶性的硫酸软骨素可经离心或过滤收集2526目前，C

9、PC法已经发展成一种既适用于微量分析，又可用于大规模生产的方法CPC-盐梯度纯化法：将糖胺聚糖混合液溶于盐溶液，加入CPC(CPC预先溶于等浓度的盐溶液，浓度为10%)，逐步稀释混合液，分批收集沉淀；或将混合糖胺聚糖水溶液与3倍CPC混合，随后逐步升高盐浓度分批解离使硫酸软骨素得以纯化27硫酸软骨素A、C结构相似，单独用CPC法进行分离是非常困难的，但两者的CPC复合物在有机溶剂中的溶解度存在差异，因此可采用CPC-纤维素柱结合加以分离，如硫酸软骨素A可以40%丙醇/20%甲醇/1.5%乙酸洗脱，而硫酸软骨素C则保留在柱上28艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸pK值存在差异（分别为3.6和3.1），因此可

10、在合适的条件下加以分离，在适当的酸性条件下，当艾杜糖醛酸的解离受到抑制时，硫酸皮肤素-CPC复合物的溶解度大大低于硫酸软骨素，此时如在0.1mol/L HAc/0.7mol/L MgCl2溶液中，硫酸皮肤素析出，而硫酸软骨素保留在溶液中29根据硫酸化程度的不同，硫酸软骨素可分为三组：非硫酸化的软骨素、单硫酸化的硫酸软骨素、多硫酸化的硫酸软骨素，糖胺聚糖-CPC可溶于某些有机溶剂，当和这些复合物的丁醇溶液相平衡的水相发生微小的盐浓度变化时，有机相中的硫酸软骨素即可向水相转移，据此，逐步提高水相的盐浓度，即可分离不同硫酸化程度的硫酸软骨素30需要指出的是，由于各种硫酸软骨素在分子量、硫酸化程度及方

11、式和糖醛酸组成等方面的不均一性，因而企图把消化液中的硫酸软骨素混合物分离成单一纯组分往往是不合实际的下图为Sigma公司硫酸软骨素C标准品的液相分析31可见，即便是Sigma公司硫酸软骨素标准品，也不可能做到结构的绝对均一3233糖胺聚糖在水溶液中经有机酸、碱或盐处理即发生不溶性沉淀，其中部分反应已用于糖胺聚调的分离纯化中透明质酸和肝素在高浓度乙酸溶液中能直接沉淀析出透明质酸在高浓度硫酸铵溶液中可被吡啶沉淀肝素与盐酸联苯胺可发生专一性沉淀牛肺提取液中经硫酸钡-乙酸沉淀，结合其他方法能得到硫酸角质素纯品34不同糖胺聚糖的钾盐在相同条件下溶解度有很大差异，应用此原理可以分批沉淀不同糖胺聚糖：如硫酸

12、角质素溶解度为3mg/mL，硫酸软骨素为0.5mg/mL，肝素为0.06mg/mL3536离子交换色谱法用于硫酸软骨素的分离纯化先于季铵盐沉淀法，并因此而导致了某些新的糖胺聚糖的发现离子交换树脂可以反复应用，因此大大节省了纯化成本温和的分离条件避免了对糖链结构的影响具有从稀溶液（包括组织消化液）中吸附糖胺聚糖的能力，从而适合大体积溶液的浓缩离子交换法可分为阴离子交换和阳离子交换37与阳离子交换相比，阴离子交换色谱更常用于不同糖胺聚糖之间的分离由于不同糖胺聚糖的分子结构不同，所携带的负电荷量不同，在阴离子交换树脂上的保留行为不同，因此，可采用不同盐浓度洗脱而得以分离383940文献常用的阴离子交

13、换树脂包括Dowex聚苯乙烯树脂、DEAE-纤维素等纤维素类树脂、DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex等葡聚糖类树脂，不同树脂各有优劣Dowex在分离清晰度方面较纤维素类为佳交联度：交联度高的树脂网眼较小，大分子的糖胺聚糖不易进入树脂内部，因此实际交换量往往较小41交换容量：纤维素类较小，而树脂类或凝胶类较大，前者一般为0.3 1.0mmol/g，后者则在2.5 3.5mmol/g左右交换剂上功能基团的解离状态也可能影响交换能力：不同交换剂的最佳交换条件各有不同，一般来说，上柱溶液中加入氯化纳至0.03 0.05mol/L可以增加吸附交换量溶液pH也可能影响交换量42硫酸软骨素

14、粗提消化液中，往往会残留蛋白质及肽等杂质。实验室中常用三氯乙酸沉淀去除杂蛋白，但不适用于生产绝大多数氨基酸的等电点均在4.0以上，因此，在pH4.0或以下的溶液中，蛋白质携带正电荷，而硫酸软骨素分子中含有糖醛酸及硫酸酯基，而携带负电荷，因此，采用阳离子交换时，蛋白质被吸附在柱上，而硫酸软骨素则被洗脱4344组织粗提液（左）、透析后（中）及阳离子交换色谱纯化后（右）的薄层色谱，经茚三酮染色后的效果4546猪软骨素粗提消化液等电点沉淀蛋白硅藻土吸附凝胶过滤色谱调pH值4.0阳离子交换色谱47经复合酶消化后的硫酸软骨素粗提液在凝胶过滤柱上的洗脱行为48粗提消化液初步纯化超滤浓缩液阳离子交换滤出液反渗

15、透生产企业在应用实验室技术时，更多地考虑效率及效益，因此，实验室技术在生产中往往要加以转换49自上世纪70年代以来，糖胺聚糖的纯化及分析技术不断涌现，并揭示了胞外基质远比预想的更具有组织性目前，除上述传统的纯化技术之外，新的纯化手段仍在不断应用于糖胺聚糖的分离纯化，并展示出糖胺聚糖丰富的生物多样性及复杂的生物功能50作为生物体内最复杂的大分子之一的糖胺聚糖，因其分子中硫酸基取代位置及二糖组装形式的不同，而拥有复杂多变的结构，从而使其拥有各种生理功能，在细胞间起着“分子弹簧”的作用，因此，在分离纯化过程中，其分子量、硫酸取代集团及二糖组成等细微结构的任何改变，都有可能影响最终产品的生物学及药理学作用51敬请指正敬请指正52